通过荧光偏振技术桥接E3连接酶结合与靶向蛋白降解

《International Journal of Molecular Sciences》：Bridging E3 Ligase Binding and Targeted Degradation Through Fluorescence Polarization

　　

尽管靶向蛋白降解（TPD）领域迅速扩展，PROTACs和分子胶的早期表征仍主要依赖细胞降解实验，这使得难以判断较差的降解效果究竟是源于次优的E3连接酶结合，还是源于降解机制中的后续步骤。此外，有效的降解依赖于平衡的二元相互作用，因为对E3连接酶或目标蛋白（POI）的结合不足或过强均会损害降解剂活性。在此，研究人员报道了用于定量测定两种最广泛应用的E3连接酶——cereblon（CRBN）和von Hippel–Lindau（VHL）——配体结合的稳健荧光偏振（FP）分析方法。利用专利荧光示踪剂，这些分析方法通过化学多样化的分子胶、临床相关的PROTACs以及经典配体进行了验证，所获得的亲和力值与已发表数据高度吻合。两种分析方法均成功微型化至384孔板规格，同时保持了分析性能，随后被标准化为即用型格式，从而促进了跨实验室的可重复亲和力测量。这些分析方法建立了一个快速且易获取的“结合优先”平台，该平台补充了细胞降解研究；支持合理的降解剂发现、谱分析和优化；并能够识别结构新颖的E3连接酶招募子。

基于荧光偏振技术的CRBN与VHL结合检测方法开发及其在靶向蛋白降解中的应用解读

一、研究背景与现存问题

靶向蛋白降解（TPD）已成为现代药物发现中最具变革性的策略之一。基于事件驱动药理学和诱导邻近的概念，TPD通过劫持负责蛋白质降解的细胞系统来促进目标蛋白（POI）的选择性消除。其中，通过泛素-蛋白酶体系统（UPS）发挥作用的降解剂引起了学术界和制药工业界极大的关注，最近雌激素受体降解剂vepdegestrant获得FDA批准，为该治疗策略提供了首个临床验证。

UPS基降解剂主要分为两类：蛋白水解靶向嵌合体（PROTACs）和分子胶（MGDs）。PROTACs是由POI配体、E3连接酶配体以及连接两者的linker组成的异双功能分子，其模块化架构使得理论上可以将任何目标配体与E3连接酶招募子进行合理组合。然而，这种架构也带来了设计挑战：成功的降解不仅需要对POI和E3连接酶都有足够的亲和力，还需要形成具有适当几何构型的、能实现泛素转移至POI上可用赖氨酸残基的生产性三元复合物。因此，二元亲和力本身并不能保证降解，而过强的二元复合物形成甚至可能通过著名的钩状效应（hook effect）降低降解效率。相比之下，分子胶是单价小分子，它们最初只与E3连接酶结合，随后重塑其表面以促进与底物或新底物的从头蛋白-蛋白相互作用。

与传统抑制剂相比，降解剂具有多种治疗优势，包括因其催化行为而在极低细胞浓度下发挥作用、抑制酶促和支架功能、延长药效学反应、克服耐药突变的可能性，以及由协同三元复合物形成带来的增强选择性。然而，该领域的快速发展也改变了药物化学的优先事项。目前，越来越多的努力集中在扩大E3连接酶招募子的化学空间，同时探索替代的出口向量（exit vectors）、创新的linker架构和以前未开发的E3连接酶。这一转变也受到当前以CRBN为基础的降解剂占主导地位的推动，这很大程度上归因于CRBN配体有利的物理化学性质。相比之下，结构更大更复杂的VHL配体使得开发口服生物可利用的VHL基降解剂更具挑战性。

正如临床候选药物所证明的那样，即使是对E3连接酶配体的微小修饰也能深刻影响降解剂的行为。然而，尽管PROTACs也需要与两个独立蛋白发生生产性相互作用，降解剂的发现仍然主要依赖细胞降解实验作为主要筛选策略。这种工作流程存在重要局限性：未能诱导降解可能源于众多独立因素，而细胞降解实验无法区分这些可能性，使得构效关系（SAR）的解释变得相当困难，并常常导致合成和评估具有次优物理化学或生物物理特性的化合物。重要的是，二元结合不应被视为降解的替代指标，而是应作为降解剂作用机制中第一个可实验检查的检查点。

二、主要关键技术方法

研究人员开发了基于荧光偏振（FP）的竞争性结合分析方法。具体而言，利用Celtarys Research公司的专利技术，分别设计和合成了针对CRBN和VHL的系列荧光示踪剂（fluorescent tracers）。通过蛋白饱和实验筛选出最优示踪剂，并对其光物理性质和化学稳定性进行了表征。随后，采用优化的竞争性FP实验方案，在96孔板和384孔板两种规格中对一系列代表性分子胶、临床相关PROTACs及经典配体进行浓度-响应曲线测定，利用四参数逻辑回归模型拟合得到半数抑制浓度（IC₅₀），并通过Cheng-Prusoff方程将其转换为抑制常数（Ki）。

三、研究结果

2.1 CRBN竞争性结合分析方法开发

2.1.1 荧光CRBN示踪剂的设计与初步表征

研究人员设计了10种荧光CRBN示踪剂，通过FP评估其产生浓度依赖性极化信号的能力以及能否被参考CRBN配体置换。结果显示，CELT-077和CELT-081表现最佳，两者均显示清晰的极化增加，且能被泊马度胺竞争性置换，确认其结合至经典的IMiD结合口袋。

2.1.2 CRBN分析方法开发与表征

通过比较CELT-077和CELT-081，发现CELT-077能准确重现泊马度胺的报告亲和力，并提供约100 mP的更宽分析窗口，因此被选为最优示踪剂。该示踪剂最大激发波长为588 nm，最大发射波长为625 nm，且在室温、4°C和-20°C条件下储存70天后均表现出优异的化学稳定性。时间进程实验表明，系统在10分钟内达到平衡，研究人员选择15分钟作为标准孵育时间。

2.1.3 用代表性分子胶和PROTACs验证CRBN荧光偏振分析方法

使用涵盖广泛报告亲和力的CRBN招募分子胶和PROTACs面板进行评估。对于分子胶，该方法正确复现了预期的亲和力排序：阿瓦度胺（avadomide, Ki=1.5 μM）< 沙利度胺（thalidomide, Ki=418 nM）< 伊伯度胺（iberdomide, Ki=17.9 nM）< 西米多胺（cemsidomide, Ki=0.68 nM），所有实测Ki值与文献值偏差小于5倍。对于PROTACs，所有测试化合物均产生良好的浓度-响应曲线，实测Ki值与文献值差异在3倍以内，并首次确定了Bexobrutideg的二元CRBN亲和力。

2.1.4 CRBN荧光偏振分析方法的微型化

该方法成功微型化至384孔板规格，无需修改实验流程。微型化后测得的Ki值与96孔板结果高度一致，且与文献值的偏差保持在3倍以内，证明了该方法的稳健性和可扩展性。

2.2 VHL竞争性结合分析方法开发

采用类似策略，从8种荧光VHL配体中筛选出CELT-504（K_D=12.6 nM）作为最优示踪剂，其激发和发射最大值分别为569 nm和578 nm。使用经典VHL配体VH298和BET降解剂MZ1进行验证，两者均产生明确的浓度-响应曲线，在96孔和384孔板中测得的Ki值与文献值吻合良好。

四、讨论与结论总结

讨论部分：

研究结果表明，二元E3连接酶亲和力可作为早期药物发现中降解剂谱分析的正交参数。通过比较实测二元E3连接酶亲和力与相应报告降解效力，发现具有强效细胞降解活性的化合物通常表现出亚微摩尔（≤500 nM）范围内的二元CRBN亲和力。虽然这一经验观察不应被解释为普适性预测阈值，但它说明了二元亲和力测量如何帮助定义药物化学优化的实用亲和力窗口。由于细胞降解效率取决于多个额外因素，二元E3连接酶亲和力本身不能预测降解剂效力，但它代表了一个合理的初筛过滤器，支持“结合优先”而非“降解优先”的工作流程。除了化合物谱分析，这些FP分析方法为发现、表征和优化新型E3连接酶招募子提供了实用且可扩展的平台。该平台也为未来开发基于FP的三元复合物协同性和靶点结合分析方法奠定了基础，并正在扩展到其他E3连接酶如DCAF家族成员。

结论部分翻译：

在这项工作中，研究人员开发了用于定量测定CRBN和VHL二元配体结合的快速且可重复的荧光偏振分析方法。CRBN分析方法使用分子胶、CELMoDs以及包括临床阶段降解剂在内的代表性PROTACs进行了验证，而较小的VHL面板则包含VH298和MZ1，反映了临床上先进的VHL招募PROTACs数量有限。实验确定的亲和力与报告值一致，并且两种分析方法均成功地在96孔和384孔板规格中实施。这些分析方法为在降解剂发现中实施“结合优先”的工作流程提供了一个实用且可扩展的工具。通过实现早期识别和优先考虑有效结合E3连接酶的化合物，有助于减少推进到更资源密集的细胞降解实验的候选化合物数量，从而提高降解剂开发的效率和通量。二元亲和力测量并非取代降解研究，而是通过提供一个早期且机制信息丰富的化合物选择标准来补充它们。该论文发表于《International Journal of Molecular Sciences》。