RT206在肝细胞中将部分PPARα/γ激动作用与配体依赖性FXR信号变构增强相偶联

《Biomolecules》：RT206 Couples Partial PPARα/γ Agonism with Ligand-Dependent Allosteric Potentiation of FXR Signaling in Liver Cells

　　

代谢功能障碍相关脂肪性肝病（MASLD）是一种以脂质处理失调和胆汁酸信号异常为特征的慢性疾病，这些过程由PPARs和FXR控制。研究人员报道，RT206——一种2-芳氧基-3-苯基丙酸衍生物——将部分PPARα/γ激动作用与FXR的正变构调节相结合。反式激活实验和内源基因表达谱分析确认了PPARα/γ响应基因的激活。RT206没有内在的FXR激动活性，但在结构不同的正构激动剂存在下，它强烈增强了HepG2细胞中FXR依赖性基因转录。光栅耦合干涉测量显示RT206与apo-FXR存在弱相互作用，而正构配体可增强该相互作用，与协同三元复合物的形成一致。对接和分子动力学支持一种模型，其中RT206结合非正构的FXR S2位点，而正构激动剂占据S1主口袋。与guggulsterone的比较揭示了不同的预测S2相互作用模式，与体外不同的转录结果相关。在脂肪酸负载的HepG2细胞中，RT206与FXR激动剂联合调节FXR和PPAR调控的代谢基因，并适度减少中性脂质积累。这些发现将RT206确定为一种概念验证支架，将部分PPARα/γ激动作用与配体依赖性FXR活性增强相结合，并支持其在更高级肝脏模型中的进一步评估。

代谢功能障碍相关脂肪性肝病（MASLD）是一种患病率约30%的慢性肝病，涵盖从单纯肝脂肪变性到代谢功能障碍相关脂肪性肝炎（MASH）的疾病谱，其发病涉及脂质代谢紊乱、炎症信号等“多重打击”机制。法尼醇X受体（FXR）是胆汁酸稳态的核心调节因子，过氧化物酶体增殖物激活受体（PPARs）则调控脂肪酸氧化和脂质代谢。现有FXR激动剂如奥贝胆酸（OCA）虽能改善肝组织学，但存在瘙痒和血脂异常等副作用；PPARα/γ完全激动剂也面临疗效或安全性局限。因此，探索能精细调节这些核受体信号的新型分子具有重要意义。此前，研究人员报道了一系列2-芳氧基-3-苯基丙酸化合物，其中化合物15（即RT206）被鉴定为对PPARα和PPARγ具有平衡部分激动活性的配体。本研究进一步揭示RT206还能在正构FXR激动剂存在下增强FXR依赖性转录，表现出正变构调节作用，为慢性肝病治疗提供了新的化学-生物学框架。

主要技术方法方面：研究采用人肝癌HepG2细胞和人胚肾HEK293T细胞，通过GAL4嵌合受体报告基因实验和全长受体报告基因实验检测PPAR、FXR及多种核受体的反式激活活性；应用RT-qPCR和Western blot检测内源靶基因mRNA和蛋白水平；使用光栅耦合干涉（GCI）技术检测RT206与重组人FXR配体结合域（LBD）的结合动力学与协同结合；通过分子对接、MM-GBSA计算、SiteMap口袋分析以及微秒级分子动力学（MD）模拟预测结合模式；并用油红O和BODIPY染色评估脂肪酸负载HepG2细胞中的中性脂质积累。

研究结果部分：

3.1 基于结构的表征将RT206确定为平衡的部分PPAR激动剂：通过分子对接和MM-GBSA评分，化合物15在PPARα/γ配体结合域中形成与已知配体S-2等相似的氢键网络和π-π堆积，且预测结合构象与S-2/S-4共晶结构高度重叠，Emax低于100%，故选为RT206进行功能验证。

3.2 RT206在反式激活实验和肝癌细胞中作为PPARα和PPARγ配体发挥作用：GAL4报告基因实验显示，RT206对PPARα的EC₅₀为1.10±0.07 μM（Emax 65%），对PPARγ为1.02±0.08 μM（Emax 28%）。在HepG2细胞中，RT206剂量依赖性地稳定PPARα/γ蛋白并上调其靶基因，如PPARα靶基因CPT1A、ACOX1和PPARγ靶基因CD36、INSIG1，同时下调CYP7A1，证明其激活内源PPAR信号通路。

3.3 GCI显示RT206结合FXR但不反式激活FXR：GCI结合实验显示RT206与apo-FXR弱结合（K_d在毫摩尔范围），但GAL4-FXR报告实验显示RT206无内在FXR激动活性；在多核受体选择性筛选中，RT206仅激活PPARα和PPARγ，不激活FXR或其他核受体。

3.4 RT206在正构激动剂存在下增强FXR依赖性转录：在HepG2细胞中，RT206单独不影响SHP、BSEP、OSTA/OSTB等FXR靶基因，但与GW4064或OCA联用时显著增强这些基因的诱导，并加强CYP7A1的抑制。选择性PPARα/γ激动剂WY-14643或罗格列酮不能模拟此增强作用，说明该作用并非依赖PPAR驱动的FXR表达交叉调节。

3.5 GCI显示RT206以配体依赖性协同方式结合FXR：GCI混合实验显示RT206与GW4064或OCA无竞争性置换，结合信号高于各组分的算术和，呈正协同；正构配体存在下RT206的表观K_d显著降低（如1 μM GW4064存在下从约2.7 mM降至794 μM），表明正构激动剂稳定了RT206的结合。

3.6 分子对接和动力学支持RT206结合FXR S2口袋：SiteMap分析在FXR各状态结构中均识别出与经典正构位点S1不同的S2“后门”口袋；1 μs MD模拟显示RT206稳定占据S2，与精氨酸R331等形成持久极性网络，而正构激动剂GW4064或OCA在S1位点保持规范结合。RT206单独结合S2的MM-GBSA能量为-57.69 kcal/mol，与弱亲和力一致；三元复合物能量略有改善，与实验观察的配体依赖性稳定相吻合。

3.7 RT206和Guggulsterone（GG）对FXR基因表达产生不同影响：GG在反式激活中呈剂量依赖性拮抗GW4064的作用（IC₅₀分别为6.1±0.5 μM和22.1±0.7 μM）。在基因表达中，GG高浓度（20–40 μM）剂量依赖性地减弱GW4064对SHP、OSTB、BSEP的诱导；低浓度则通过AP-1途径激活BSEP、NQO1和MYC，呈现双相效应，而RT206始终表现为正变构增强。

3.8 比较计算分析揭示了GG对FXR调节作用的见解：MD模拟显示GG也占据S2口袋，但主要依赖疏水接触，缺乏RT206以R331为中心的持久极性锚定；GG还诱导GW4064或OCA在S1位点的构象位移和局部灵活性增加，与RT206稳定活性构象的模式相反，为其拮抗或选择性调节活性提供了结构解释。

3.9 RT206在序贯体外脂肪变性模型中保留PPAR活性和配体依赖性FXR增强作用：在油酸/棕榈酸（2:1）负载的HepG2细胞中，若药物与含BSA的脂肪酸混合物同时加入（24 h模型），GW4064/RT206协同效应丧失；改用“24 h脂肪负载+24 h无BSA药物处理”序贯方案后，RT206仍能增强GW4064或OCA诱导的SHP、BSEP、OSTA/OSTB表达，激活CPT1A、ACOX1、INSIG1，并使中性脂质积累减少约15%，表明BSA对疏水小分子的螯合会降低有效暴露量，而非RT206活性丧失。

讨论部分总结：RT206是首个将部分PPARα/γ激动作用与配体依赖性FXR正变构调节整合于同一分子骨架的概念验证化合物。与已报道的FXR/PPAR双重激动剂不同，RT206对FXR并非正构激活，而是在正构激动剂占据S1位点后通过S2位点发挥协同增强作用。与GG的比较说明S2占据本身不决定功能方向，RT206的定向极性网络和稳定的H12构象可能与其正变构效应相关。局限性包括未进行受体特异性敲低实验、缺乏直接结构证据，且HepG2脂肪变性模型不能完全模拟MASLD的系统性病理，下一步需通过S2关键残基（如R331）定点突变和体内研究验证。

研究结论部分翻译：本研究证明，RT206作为部分PPARα/γ激动剂，并通过与FXR S2位点结合的机制增强正构FXR激动剂信号。这种双重活性为在单一分子骨架中协调脂肪酸氧化和胆汁酸信号提供了化学-生物学框架。其是否能转化为优于现有策略的疗效或耐受性，有待专项体内和转化研究确定。