1型糖尿病两种模型中视网膜蛋白质组学分析

《Biomolecules》：Proteomic Analysis of Retinas from Two Different Type-1 Diabetic Models

　　

本研究利用两种糖尿病视网膜病变（diabetic retinopathy，DR）的1型糖尿病（type-1 diabetes mellitus，T1DM）小鼠模型，即遗传性Ins2akita/+（Akita）模型与链脲佐菌素（streptozotocin，STZ）诱导糖尿病模型，探讨T1DM相关视网膜蛋白质组改变。糖尿病发生后15–16周收集Akita（n=4）与STZ诱导糖尿病小鼠（n=6）视网膜，并与年龄匹配对照组比较。定量质谱在Akita视网膜鉴定7933个蛋白质，在STZ视网膜鉴定7399个蛋白质。研究人员使用校正后p值与log2倍变化识别差异表达蛋白质，按曼哈顿距离（Manhattan distance）排序，并以火山图与热图可视化。两模型各取前20个失调蛋白质进行经典通路分析。两模型均显示炎症与血管生成相关蛋白质上调，包括LRRC58、coronin-2A、S100-A4与COL4A2，支持促炎与血管重塑微环境。但两模型部分蛋白质变化不同，如晶体蛋白（crystallins）在STZ模型下调、在Akita模型上调，并经Western blot验证。经典通路分析显示血小板相关信号通路激活、脂质代谢网络富集以及细胞外基质（extracellular matrix，ECM）组织显著改变。这些发现表明DR中存在协调的炎症、代谢与结构重塑，并识别出可作为进一步研究与治疗靶点的候选分子通路。

研究背景方面，糖尿病视网膜病变（diabetic retinopathy，DR）是糖尿病（diabetes mellitus，DM）重要微血管并发症，也是全球视力损害与盲的主要原因之一。DR患病率预计在未来数十年显著上升。其病理从非增殖性DR（non-proliferative DR，NPDR）进展至增殖性DR（proliferative DR，PDR），伴随血视网膜屏障（blood-retinal barrier，BRB）破坏、血管渗漏与视网膜新生血管。现有激光光凝与玻璃体内药物如抗血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）等治疗存在副作用。Akita小鼠（Ins2^akita/+）与链脲佐菌素（streptozotocin，STZ）诱导小鼠均为T1DM模型，但两模型视网膜损伤分子机制仍不完全清楚。高分辨质谱发展使更全面视网膜蛋白质组表征成为可能，因此研究人员开展探索性发现蛋白质组学研究，论文发表于《Biomolecules》。

关键技术方法方面，研究人员使用雄性Akita小鼠与STZ诱导雄性野生型小鼠，另设年龄匹配野生型对照，糖尿病发生后约16周取眼球并分离视网膜；Akita组n=4、对照n=4，STZ组n=6、对照n=5。样本经匀浆与酶解后，采用数据非依赖采集（data-independent acquisition，DIA）质谱与Orbitrap Eclipse仪器进行定量蛋白质鉴定。数据分析使用VolcaNoseR绘制火山图，按曼哈顿距离排序；R进行z分数标准化与双向层次聚类热图；QIAGEN Ingenuity Pathway Analysis（IPA）做经典通路富集；STRING数据库构建蛋白质-蛋白质相互作用（protein-protein interaction，PPI）网络与功能富集；并以Western blot验证候选晶体蛋白。

3.1. Top 20 Dysregulated Proteins in Akita Group

研究人员通过火山图与曼哈顿距离排序获得Akita组前20个失调蛋白质，其中15个上调、5个下调。免疫球蛋白κ常数区（immunoglobulin kappa constant，IGKC）上调最显著，WAP四二硫键核心域蛋白12（WFDC12）下调最明显。热图显示Akita样本与对照分离，免疫球蛋白相关、急性期蛋白与丝氨酸蛋白酶抑制剂协调上调，CryβB2与神经元相关蛋白下调。

3.2. Canonical Pathway Analysis of Akita Group

IPA显示整合素细胞表面相互作用富集最显著。Z分数预测血小板胞质Ca²⁺反应、急性期反应信号、内源性配体调控TLR（Toll-like receptor）、LXR/RXR激活与DHCR24信号激活；整合素细胞表面相互作用、GP6信号、胶原纤维与其他多聚体结构组装、胶原降解受抑制。

3.3. Top 20 Dysregulated Proteins in STZ Group

STZ组前20个失调蛋白质中10个上调、10个下调。主要尿蛋白20（major urinary protein 20，MUP20）上调最显著，γ-crystallin B下调最显著。热图显示STZ样本聚为一类，α、β、γ晶体蛋白家族协调下调，IgHm、Thra、Ermn、Clic6等呈组别差异表达。

3.4. Canonical Pathway Analysis of STZ Group

IPA显示细胞外基质（extracellular matrix，ECM）组织、胶原链三聚化与中性粒细胞胞外诱捕网（neutrophil extracellular trap，NET）信号富集。多数通路上调，NET信号预测受抑制，肝纤维化/肝星状细胞激活无明确方向。

3.5. PPI Network Analysis

Akita组14个显著失调蛋白质中12个进入STRING网络，仅S100a6–S100a4与Serpina1e–Orm1有互作，其余节点离散。STZ组8个中7个进入网络，仅Crygc–Crygb有强功能连接，其余节点无预测互作。两模型无重叠显著失调蛋白质。

3.6. Functional Enrichment and Pathway Analysis of the Dysregulated Proteins

Akita组GO与Reactome富集聚焦胶原与ECM架构、血小板源生长因子结合、S100蛋白结合及胶原纤维交联。STZ组富集聚焦相机型眼晶状体发育、结构 constituent of eye lens、剪接体复合体、ECM组织、角质化与胶原含ECM。

3.7. Retinal Expression of β B-Crystallins in Akita and STZ Mice

Akita组βB2-crystallin（βB2-Crys）Western blot呈非显著上升趋势；STZ组独立三批样本显示βB2-Crys较对照显著下降，与蛋白质组方向一致。

讨论部分总结，研究人员指出Akita与STZ模型虽无共同显著失调蛋白质，但共享炎症、ECM重塑与脂质代谢等通路，说明遗传与化学诱导T1DM通过不同节点进入共同功能障碍网络。Akita视网膜晶体蛋白上调可能具代偿神经保护意义，STZ视网膜晶体蛋白下调提示内源保护机制受损。免疫球蛋白、急性期蛋白、血小板与凝血相关通路支持DR慢性炎症与血管应激。ECM相关通路在Akita偏抑制、在STZ偏激活，反映模型间基质重塑模式不同。LRRC58、coro2a、S100-A4、COL4A2等可作为DR炎症与血管重塑候选靶点。样本量较小但严格阈值使发现集仍具探索价值。

结论部分翻译如下：

总体而言，蛋白质组学分析识别出大量具有机制与治疗相关性的DR失调蛋白质。LRRC58与coronin-2A在两模型一致上调，支持促炎视网膜环境；S100-A4与COL4A2升高符合血管生成与血管重塑过程。相反，若干晶体蛋白家族成员下调，提示内源应激反应与神经保护机制受损。恢复晶体蛋白通路是否具治疗获益值得研究。经典通路分析显示血小板相关信号激活，提示血小板活性增强、微血栓形成及可能的血视网膜屏障破坏；脂质相关通路富集指示代谢失调，ECM组织与重塑显著改变，与DR结构性血管变化一致。上述通路层面发现为机制优先级排序与目标验证提供系统框架。