《Biomolecules》：Split Intein-Mediated Engineering of Bacteriocins Through Backbone Circularization, Modular Assembly of Chimeras, and Inducible Circularization
编辑推荐：
抗菌素耐药性的日益普遍重新引起了人们对细菌素和其他抗菌肽作为传统抗生素有前景替代品的兴趣。在此背景下，体外无细胞蛋白质合成（in vitro cell-free protein synthesis, IV-CFPS）为细菌素的产生和功能评价提供了一个快速且多功
抗菌素耐药性的日益普遍重新引起了人们对细菌素和其他抗菌肽作为传统抗生素有前景替代品的兴趣。在此背景下，体外无细胞蛋白质合成（in vitro cell-free protein synthesis, IV-CFPS）为细菌素的产生和功能评价提供了一个快速且多功能的平台，能够在不涉及细胞表达、低产量或肽毒性相关限制的情况下进行抗菌筛选。在先前的研究中，研究人员证明了IV-CFPS在多种细菌素的产生和表征方面的实用性。最近，IV-CFPS与分裂内含肽介导的连接（split intein-mediated ligation, SIML）的整合使得环状细菌素的产生和功能评价成为可能，从而扩大了可通过无细胞合成和筛选获得的细菌素范围。在此，研究人员通过三种互补的细菌素工程策略进一步扩展了IV-CFPS/SIML平台的能力。首先，SIML被应用于天然线性细菌素的骨架环化，证明SIML介导的环化可以扩展到天然环状细菌素之外。其次，该平台通过连接相同或不同大肠杆菌素（colicin）的转运/受体结合（translocation/receptor-binding, T-R）结构域和细胞毒性（cytotoxic, C）结构域，实现了嵌合细菌素的模块化组装。最后，研究人员开发了一个概念验证的诱导型蛋白质反式剪接系统，其中通过添加互补的分裂内含肽组分触发细菌素环化，从而对肽激活提供时间控制。这些结果确立了IV-CFPS/SIML作为一个可编程细菌素工程的多功能平台，并显著扩展了其超越天然环状细菌素生产之外的应用。
抗菌素耐药性（antimicrobial resistance, AMR）的全球蔓延促使科学家寻求替代传统抗生素的新策略。细菌素（bacteriocin）作为一类由核糖体合成的抗菌肽或蛋白质，具有活性强、作用机制多样、靶谱相对狭窄等特点，在食品保藏、兽医学和人类健康领域显示出广阔的应用前景。然而，大多数已知细菌素的工程改造仍依赖传统重组表达系统，常面临宿主毒性、分泌或免疫系统缺失、异源产量低等问题。体外无细胞蛋白质合成（in vitro cell-free protein synthesis, IV-CFPS）能够在无细胞约束条件下快速合成并功能评价抗菌肽，克服了上述部分限制。然而，对于需要翻译后修饰的核糖体合成及翻译后修饰肽（ribosomally synthesized and post-translationally modified peptides, RiPPs），特别是具有头尾环状拓扑结构的环状细菌素，体外生产仍具挑战。研究人员此前开发了将IV-CFPS与分裂内含肽介导的连接（split intein-mediated ligation, SIML）相结合的平台，利用蛋白质反式剪接（protein trans-splicing）实现天然环状细菌素的体外生产，但SIML作为通用细菌素工程平台的潜力尚未被充分挖掘。本研究旨在通过三种互补策略扩展该平台：天然线性细菌素的骨架环化、基于功能域模块化组装的嵌合细菌素构建，以及诱导型蛋白质反式剪接系统的开发，从而实现可编程的细菌素工程。
研究人员选取了结构多样的革兰氏阳性和阴性细菌素，包括aureocin A53、enterocin A、enterocin HF、hiracin JM79、colicin M、microcin V、colicin Ib、colicin E6、colicin S4、colicin D和salmocin E1B，涵盖不同家族和分子尺寸。所有构建体均将成熟肽编码序列置于Nostoc punctiforme DnaE（Npu DnaE）分裂内含肽的N端片段（NpuN）和C端片段（NpuC）之间，以通过反式剪接实现环化。环化位点依据剪接兼容的丝氨酸或半胱氨酸残基选择。对于嵌合组装，将colicin K和salmocin E1B的转运/受体结合（translocation/receptor-binding, T-R）结构域分别融合至NpuN，其相应细胞毒性（cytotoxic, C）结构域融合至NpuC，独立表达后混合以诱导结构域连接。诱导型系统则采用Cat分裂内含肽层级重构NpuN：将截短的NpuN片段（NpuNA）与CatC融合，CatN与NpuN剩余片段（NpuNB）融合，混合后先由Cat介导重构完整NpuN，再触发与NpuC的反式剪接。所有蛋白均通过IV-CFPS（PURExpress系统）合成，室温孵育24小时促进剪接。抗菌活性采用斑点琼脂试验（spot-on-agar test, SOAT）和微量滴定板法（microtiter plate assay, MPA）测定，指示菌株包括Escherichia coli DH5α、Pediococcus damnosus CECT 4797和Listeria monocytogenes CECT 4032。此外，为排除产量差异影响，化学合成了线性及环化enterocin A，比较其内在活性。
### 3.1 SIML介导天然线性细菌素的骨架环化
研究人员将11种天然线性细菌素改造成头尾环化变体，通过选择内部丝氨酸或半胱氨酸作为+1亲核残基，重排序列而不改变氨基酸组成。活性测定显示，环化变体的活性具有明显的细菌素依赖性：salmocin E1B和colicin M的环化形式对E. coli DH5α保留活性；aureocin A53、enterocin A和hiracin JM79的环化形式对P. damnosus CECT 4797保留活性；而colicin S4、colicin E6、colicin Ib、colicin D、microcin V和enterocin HF的环化变体未检测到活性。进一步通过化学合成获得纯化的线性及环化enterocin A，比较发现环化enterocin A的抗菌活性显著低于线性形式，表明头尾环化可能破坏了肠球菌素A发挥最优活性所需的结构柔性。该结果证明SIML环化可扩展至天然线性细菌素，但内在活性可能因拓扑约束而受损。
### 3.2 SIML介导嵌合细菌素的模块化组装
以colicin K（ColK）和salmocin E1B（SalE1B）为模型，利用SIML实现T-R和C结构域的反式剪接组装。将全长线性蛋白作为参比，结果显示亲本组合（ColK T-R + ColK C；SalE1B T-R + SalE1B C）均保留抗菌活性，但抑制圈小于相应全长蛋白。在嵌合组合中，仅SalE1B T-R + ColK C表现出可检测活性，而ColK T-R + SalE1B C无活性。这说明SIML可以介导结构域的共价连接，但最终抗菌活性依赖结构域间的功能兼容性，并非所有模块组合都能形成有功能的嵌合细菌素。该策略避免了对每个嵌合体重建质粒，为组合式细菌素设计提供了高通量平台。
### 3.3 诱导型SIML平台用于时间可控的细菌素环化
为实现环化过程的时间调控，研究人员构建了基于Cat和Npu DnaE双内含肽的层级系统。编码Cat介导NpuN重构的构建体和用于enterocin As-48环化的SIML构建体分别经IV-CFPS表达后，单独测试均无抗菌活性，说明在缺乏Cat重构时不会自发环化。将两者混合后出现明显抗菌活性，证明Cat介导的第一步反式剪接成功重构了完整的NpuN，进而驱动第二步Npu DnaE介导的环化。该诱导系统的活性比组成型IV-CFPS/SIML系统低约8倍，原因可能在于需要连续两步反式剪接导致效率累积降低，也可能涉及中间体折叠或空间位阻效应。该设计为异源生产中避免过早环化所致宿主毒性提供了概念验证。
讨论部分指出，SIML工程的成败高度依赖具体细菌素支架。无活性不一定代表环化失败，因为IV-CFPS/SIML反应混合物可能含有未剪接前体、部分加工中间体和正确环化产物，活性检测反映的是整体混合物的活性，而非单一环化产物。剪接效率受连接位点侧翼残基（尤其是?1/+1位点）和局部结构环境影响。对于嵌合组装，结构域的折叠状态和剪接前构象会影响反式剪接效率和最终活性。诱导平台证明了通过层级内含肽重构实现条件性控制的可行性，但需要进一步优化以提高整体效率。
研究结论部分原文翻译如下：在这项工作中，研究人员通过在体外无细胞蛋白质合成框架内开发三种互补策略，大幅扩展了分裂内含肽介导的连接（SIML）作为抗菌肽工程多功能平台的范围。首先，SIML实现了天然线性细菌素的骨架环化，证明SIML介导的环化可扩展至天然环状细菌素之外，以产生具有潜在增强理化性质的工程变体。其次，分裂内含肽被成功用于通过独立产生的功能域的连接来模块化组装嵌合细菌素，凸显了其作为组合细菌素工程的可编程分子连接器的潜力。最后，研究人员开发了一种诱导型SIML系统，能够实现时间可控的细菌素环化，为通过可控分裂内含肽重构来促进异源生产同时最小化细胞内毒性提供了概念验证。尽管需要进一步优化以提高蛋白质反式剪接效率、连接点设计以及工程后抗菌活性的保持，但不同细菌素支架上观察到的异质性结果强调，SIML介导的细菌素工程的成功本质上是细菌素依赖性的。因此，该平台的未来应用将受益于将结构和机制知识整合到构建设计中，以指导选择最适合个体细菌素支架的工程策略。本文描述的方法显著拓宽了分裂内含肽介导组装在细菌素研究中的潜在应用。更广泛地说，IV-CFPS与SIML的整合为工程化细菌素的原型设计、模块化组装和功能评价提供了一个快速且灵活的框架，从而加速了下一代环状抗菌肽、多结构域蛋白细菌素和其他工程化肽类治疗药物的开发。
