《Molecules》：Cell Reporter-Based Analysis of Anti-Inflammasome Activities of Flavonoids with Distinct Structures
编辑推荐：
黄酮类(flavonoids)为天然化合物，在慢性炎性状态干预中具潜力。尽管共享共同母核骨架，黄酮类结构异质性显著，各亚类生物活性比较仍有限，且常受传统分析方法成本与灵敏度限制。本研究旨在验证HEK-Blue IL-1R细胞这一基于细胞的报告系统，作为免疫检测
黄酮类(flavonoids)为天然化合物，在慢性炎性状态干预中具潜力。尽管共享共同母核骨架，黄酮类结构异质性显著，各亚类生物活性比较仍有限，且常受传统分析方法成本与灵敏度限制。本研究旨在验证HEK-Blue IL-1R细胞这一基于细胞的报告系统，作为免疫检测替代方案，用于评估黄酮类对巨噬细胞炎症小体驱动的IL-1β分泌的结构-活性关系。在脂多糖(LPS)轻度炎症刺激下，该报告系统对低水平IL-1β信号检出灵敏且高效。研究人员对极性、糖基化不同的三种黄酮类进行比较：槲皮素(quercetin)为极性苷元(aglycone)，川陈皮素(nobiletin)为甲氧基化苷元，二者相对LPS刺激对照均显著抑制报告响应，且槲皮素抑制趋势更强；而槲皮素糖基化衍生物芦丁(rutin)未检出抑制效应。上述发现与负责IL-1β成熟和分泌的NLRP3炎症小体蛋白表达一致。综上，结果支持黄酮类苷元对抗炎症小体相关炎症的潜力，并凸显HEK-Blue IL-1R报告系统可作为低度炎症下筛查IL-1β信号的灵敏、低成本平台。
研究背景方面，低度炎症(low-grade inflammation)参与动脉粥样硬化、癌症、胰岛素抵抗及阿尔茨海默病等慢性非传染性疾病发生发展。急性炎症具保护功能，而系统慢性炎症常由稳态失衡引发并可损伤健康组织。现有非甾体抗炎药(NSAIDs)与糖皮质激素长期应用不良反应明显。NLRP3炎症小体属先天免疫核心组分，其活化分两步：炎症条件下损伤相关分子模式(DAMPs)/病原相关分子模式(PAMPs)等启动信号经受体介导NF-κB诱导NLRP3、pro-IL-1β与pro-IL-18表达；继之NLRP3与pro-caspase-1、含CARD的凋亡相关斑点样蛋白(ASC)组装，活化的caspase-1加工pro-IL-1β与pro-IL-18并分泌成熟细胞因子。因此成熟IL-1β信号是炎症小体活化及抑制剂药效的功能性生物标志物。黄酮类具3环15碳母核，黄酮醇(flavonols)于中央环3位带羟基、黄烷酮(flavones)缺此基团，柑橘来源黄烷酮如川陈皮素富含甲氧基而极性低。常规酶联免疫吸附测定(ELISA)对低度炎症的细微细胞因子变化不够灵敏，超敏平台又昂贵耗时，故研究人员开展本研究，用HEK-Blue IL-1R报告系统（稳转人IL-1R并携NF-κB/AP-1诱导分泌型胚胎碱性磷酸酶(SEAP)报告基因）比较川陈皮素、槲皮素、芦丁对小鼠骨髓源巨噬细胞(BMMs)低度炎症下IL-1β信号的影响，论文发表于《Molecules》。
主要关键技术方法上，研究人员以C57BL/6J小鼠来源BMMs为原代巨噬细胞模型，用LPS 10 ng/mL处理24 h建立低度炎症模型；以Lumit?小鼠IL-1β发光免疫法作对照；采用HEK-Blue IL-1R报告细胞经QUANTI-Blue显色读取640 nm光密度(OD)量化SEAP以反映生物活性IL-1α/IL-1β信号；以乳酸脱氢酶(LDH)释放评估BMM与报告细胞毒性；以Western blot分析NLRP3、ASC、pro-caspase-1、cleaved caspase-1(p20)等炎症小体相关蛋白。
研究结果部分，2.1 IL-1β Detection Approaches下，2.1.1 Bioluminescence-Based Immunoassay中，研究人员用发光免疫法测BMM上清，LPS组均值36.3 pg/mL、对照3 pg/mL，虽显著但对照接近最低标准以下，低度炎症情景下抑制效应判读受限。2.1.2 Cell-Based Functional Assay中，HEK-Blue对1–10000 pg/mL IL-1β拟合优度好，10–100 pg/mL为曲线陡段；用25% BMM上清孵育报告细胞24 h，LPS来源上清OD显著高于对照，5–15 min内组间差异稳定，选10 min为读数点。2.2 Structure-Dependent Inhibition of NLRP3 by Flavonoids下，2.2.1 Bioactive IL-1β Levels中，BMM经黄酮类5–50 μM预处置30 min后LPS刺激，LPS使SEAP约4倍升高；川陈皮素与槲皮素10 μM抑制最强，槲皮素抑逾80%、川陈皮素约50%，槲皮素整体略优但组间无统计显著；芦丁各浓度均无影响。LDH与吸光度质控表明黄酮类不在640 nm/490 nm干扰，且不抑制报告细胞对重组IL-1β的SEAP响应。2.2.2 NLRP3 Inflammasome Protein Levels中，LPS显著诱导NLRP3、pro-caspase-1略升、ASC不变、cleaved caspase-1低水平；两苷元抑NLRP3与cleaved caspase-1、弱抑pro-caspase-1，芦丁无作用，与报告结果一致。
讨论部分总结，研究人员指出低度炎症需长期适用疗法，天然黄酮类安全性佳但结构功能团差异致活性异质。HEK-Blue虽不能区分IL-1α/IL-1β，但Western结果支撑其反映NLRP3相关信号。羟基化苷元抑炎更强、甲氧基化利代谢稳定性与亲脂性，糖基化在细胞中活性低但体内可被肠菌/酶水解为苷元，且糖苷形式或可提升槲皮素净吸收，故体外结论不能直接外推体内。研究者建议以IL-1β/IL-1α中和抗体或成熟IL-1β特异免疫法补足报告系统。
结论部分译文：慢性炎症仍是重大临床挑战，亟需适于长期使用的疗法。本研究评估一种报告细胞系作为免疫检测替代方案，以比较结构相异黄酮类对巨噬细胞IL-1β分泌的影响。HEK-Blue-IL-1R报告系统在低细胞因子浓度下灵敏度与线性良好，可有效区分弱炎症信号与背景。报告响应与炎症小体相关蛋白Western blot一致，支持该平台用于低度炎症下生物活性IL-1β变化检测。两法均支持川陈皮素与槲皮素这类黄酮类苷元的抗炎症小体活性，而糖基化黄酮醇芦丁在所用条件下无检出效应。虽川陈皮素与槲皮素差异未达统计显著，槲皮素抑制略强，与羟基化可能增强黄酮类抗炎活性一致。鉴于代谢与心血管疾病等慢性炎症状态循环IL-1β浓度低、近常规免疫检测下限，HEK-Blue-IL-1R报告平台可为靶向炎症小体相关炎症信号的化合物与策略筛查提供灵敏高效途径。
