《Cancers》：LSD1 Promotes Immune Exclusion and Suppresses IFN-γ-Associated Transcriptional Programs in Triple-Negative Breast Cancer
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背景：三阴性乳腺癌（TNBC）具有侵袭性生物学行为及异质性免疫浸润特征。赖氨酸特异性去甲基化酶1（LSD1/KDM1A）是一种参与致癌性转录程序的表观遗传调控因子，但其在免疫排斥中的作用尚未完全明确。方法：研究人员通过免疫组织化学方法评估TNBC标本中LSD1
背景：三阴性乳腺癌（TNBC）具有侵袭性生物学行为及异质性免疫浸润特征。赖氨酸特异性去甲基化酶1（LSD1/KDM1A）是一种参与致癌性转录程序的表观遗传调控因子，但其在免疫排斥中的作用尚未完全明确。方法：研究人员通过免疫组织化学方法评估TNBC标本中LSD1的表达，并将其与生存期进行关联分析。在TNBC细胞系及患者来源异种移植类器官（PDXOs）中评估了LSD1缺失或药理抑制的功能效应。整合转录组学、ChIP-seq、多重免疫荧光及GeoMX数字空间谱分析，以表征LSD1相关的转录、染色质及免疫程序。通过PBMC-PDXO共培养体系评估LSD1抑制对肿瘤生长及免疫细胞浸润的影响。结果：LSD1高表达与较差的总生存期、缺氧相关程序及免疫通路抑制相关。LSD1高表达肿瘤表现出T细胞、B细胞、NKT样细胞及巨噬细胞浸润减少。空间谱分析显示，B细胞和T细胞区域中分别存在先天免疫应答及I型干扰素信号传导的抑制。ChIP-seq显示LSD1优先占据AP-1基序富集区域，而免疫共沉淀支持其与AP-1复合物的关联。将LSD1染色质占据位点与转录组学数据整合分析，确定SPPL2A和NCOA3为与干扰素-γ应答通路相关的候选LSD1调控基因。LSD1缺失可上调SPPL2A、NCOA3、MHC-I及PD-L1的表达。LSD1抑制可减少PDXO生长并增加免疫细胞浸润。结论：LSD1与TNBC不良临床结局及免疫排斥相关。这些发现支持LSD1在AP-1相关染色质调控及干扰素-γ相关转录应答中的作用，并为将LSD1抑制作为免疫冷TNBC治疗策略提供了进一步研究的依据。
**论文解读：LSD1在TNBC中驱动免疫排斥的临床、染色质与功能证据**
**研究背景与问题**
三阴性乳腺癌（TNBC）占所有乳腺癌的15%–20%，以侵袭性强、早期复发率高及靶向治疗选择有限著称。尽管免疫检查点阻断改善了一部分患者的预后，但许多TNBC肿瘤呈现免疫排斥或“冷”表型，T细胞浸润差，导致免疫治疗响应有限。表观遗传失调，包括染色质构象异常和基因调控元件活性改变，在肿瘤免疫监视和免疫逃逸中发挥关键作用。赖氨酸特异性去甲基化酶1（LSD1/KDM1A）是一种组蛋白去甲基化酶，可去除H3K4和H3K9上的单甲基和二甲基基团，并根据其相关蛋白复合物调节转录激活或抑制。既往研究已确立LSD1在TNBC中的多种致癌功能，包括促进肿瘤进展、转移和治疗抵抗；在基因工程小鼠模型中，乳腺特异性LSD1敲除显著降低肿瘤发生率。此外，LSD1抑制可增加T细胞趋化因子、增强CD8+ T细胞浸润，并改善化疗及免疫检查点阻断的疗效。然而，LSD1是否通过协调调控染色质相关转录程序直接促进免疫排斥、其临床意义及转录合作伙伴和直接免疫相关靶基因尚不明确。
**研究目的与设计**
研究人员结合临床队列分析、多重免疫荧光、数字空间转录组学、染色质免疫沉淀测序（ChIP-seq）及患者来源功能模型，系统定义LSD1在TNBC中的作用。研究纳入了新加坡中央医院2003–2014年间337例可评估TNBC标本，并利用公共TCGA队列进行验证。通过免疫组化评估LSD1表达，采用多重免疫荧光定量多种免疫细胞亚群浸润，使用GeoMX数字空间谱分析比较不同免疫区室的转录特征。在细胞系中通过shRNA敲低或药理抑制剂（SP2509、苯乙肼）处理，结合RNA-seq和ChIP-seq鉴定LSD1的染色质结合位点及下游靶基因。最后，利用患者来源异种移植类器官（PDXO）单培养和外周血单个核细胞（PBMC）-PDXO共培养模型评估LSD1抑制对肿瘤生长及免疫细胞浸润的影响。
**主要技术方法**
研究人员使用了以下关键技术：(1) 组织微阵列（TMA）结合免疫组化（IHC）评估337例TNBC标本的LSD1核表达（H-score）；(2) 多重免疫荧光定量肿瘤内CD3+、CD8+、CD4+、CD20+、CD56+CD16+及CD68+免疫细胞浸润；(3) GeoMX数字空间谱分析（DSP）对CD20+ B细胞区和CD8+ T细胞区进行转录组分析；(4) RNA-seq及ChIP-seq分析LSD1全基因组结合位点，并结合HOMER基序分析鉴定富集的转录因子结合基序；(5) PBMC-PDXO三维共培养体系评估药物对肿瘤体积和免疫浸润的影响。样本队列来源包括新加坡中央医院队列和公共TCGA数据库。
**研究结果**
**3.1 LSD1表达与TNBC免疫浸润减少及生存期缩短相关**
对337例TNBC标本的IHC分析显示，核LSD1表达在肿瘤间存在异质性。采用预设H-score cutoff（>2.5，第20百分位），LSD1阳性与较短的总体生存期显著相关；TCGA队列中LSD1高分层患者也表现出更差的无病生存期和总生存期。基因本体分析显示，LSD1阳性患者富集缺氧相关信号通路，而免疫相关通路受到抑制。实验验证显示，LSD1缺失降低了缺氧相关因子（HIF-1α、VEGFA）和细胞周期调节因子MYC的蛋白水平，同时增加了整体H3K4me1/2和H3K9me1/2水平。LSD1抑制显著减少乳腺癌细胞的集落形成和增殖。多重免疫荧光显示，LSD1高肿瘤中CD3+、CD4+、CD8+ T细胞（包括初始和活化亚群）、CD20+ B细胞、CD3+CD56+ T/NKT样细胞、CD68+巨噬细胞浸润均降低，PD-L1表达也较低。GeoMX空间谱分析进一步显示，LSD1阳性肿瘤的CD20+ B细胞区域中先天免疫应答基因下调，CD8+ T细胞区域中I型干扰素信号通路基因下调。
**3.2 LSD1在TNBC中富集于AP-1染色质区域并与AP-1复合物物理结合**
对MDA-MB-231（TNBC）、MCF7（腔面型）和MCF10A（正常样）细胞进行LSD1 ChIP-seq分析，鉴定出2807个在TNBC细胞中差异增加的LSD1结合位点。这些位点相关基因显著富集于上皮-间质转化（EMT）、炎症反应等肿瘤相关通路。已知及从头基序富集分析显示，LSD1占据区域显著富集AP-1（JUN/FOS）结合基序（p < 1×10??）。免疫共沉淀实验表明，抗LSD1抗体能够共沉淀AP-1复合物蛋白，支持两者在TNBC细胞中的物理关联。
**3.3 ChIP-seq与患者转录组整合分析确定候选靶基因**
将TNBC细胞中差异LSD1结合峰、细胞系中下调的差异表达基因以及TCGA LSD1高分层患者中下调的差异表达基因进行交集分析，获得13个候选LSD1靶基因，其中6个在启动子区域（TSS±2.5 kb）存在差异LSD1结合。对这6个启动子相关靶基因进行基因集富集分析，发现“干扰素γ应答”通路显著富集，SPPL2A和NCOA3为领先候选基因。IGV轨迹显示MDA-MB-231细胞中LSD1在SPPL2A和NCOA3启动子区域有明显富集。
**3.4 IFN-γ候选靶基因验证及对免疫识别标志物的影响**
shRNA介导的LSD1敲低显著上调TNBC细胞中NCOA3和SPPL2A的mRNA表达，与LSD1介导转录抑制的解除一致。流式细胞术分析表明，shRNA敲低和药理抑制LSD1均显著增加细胞表面主要组织相容性复合体I类（MHC-I）和程序性死亡配体1（PD-L1）的表达，提示LSD1抑制促进IFN-γ反应性肿瘤细胞表型，表现为抗原呈递增加及适应性PD-L1检查点诱导。
**3.5 LSD1抑制减少TNBC类器官生长并增强免疫细胞浸润**
在PDXO单培养中，LSD1抑制剂（SP2509、苯乙肼）单独或联合化疗均显著降低TNBC类器官（BR5337B）的平均体积，其抗肿瘤效果与顺铂相当。PBMC-PDXO共培养前，SP2509最高剂量（10 μM）不影响PBMC活力。共培养实验中，SP2509显著降低肿瘤体积，而pembrolizumab（抗PD-1）单独未产生显著减少；SEA作为免疫刺激对照显著降低肿瘤体积。免疫细胞浸润定量显示，SP2509、pembrolizumab或其联合治疗均显著增加肿瘤类器官内免疫细胞浸润，其中SEA+SP2509+pembrolizumab三联组合的浸润水平最高。
**讨论与结论**
研究通过多组学整合分析表明，LSD1高表达与TNBC免疫排斥、缺氧程序及不良预后相关。染色质分析提示AP-1复合物可能是LSD1在TNBC中的染色质伙伴，SPPL2A和NCOA3作为潜在直接转录靶点连接LSD1与IFN-γ应答通路。功能实验证实LSD1抑制可增强肿瘤免疫原性、减少类器官生长并促进免疫细胞浸润。研究局限性包括：临床关联无法直接证明因果关系；大部分机制验证在单一TNBC细胞系（MDA-MB-231）中完成；苯乙肼存在脱靶效应；类器官-PBMC共培养模型不能完全模拟肿瘤微环境复杂性；AP-1的功能必要性及SPPL2A/NCOA3的直接功能贡献仍需进一步研究。结论指出，LSD1是表观遗传调控、肿瘤内在转录程序与TNBC免疫排斥之间的潜在联系，支持LSD1作为侵袭性免疫冷疾病的生物标志物和联合免疫治疗的候选靶点。该研究为免疫冷TNBC的靶向治疗提供了转化框架，论文发表于《Cancers》。
