高通量测序揭示黄土高原生态敏感区优势植物根际微生物群落的组成、多样性及功能预测

《Microorganisms》：High-Throughput Sequencing Reveals Composition, Diversity, and Functional Prediction of Root-Associated Microbial Communities of Dominant Plants in an Ecologically Sensitive Area of the Loess Plateau

　　

摘要：祁连山高寒矿区生态系统脆弱，采矿扰动导致土壤严重退化，自然恢复缓慢。为阐明原生优势植物根际微生物的生态恢复潜力，本研究调查了天祝矿区7种原生优势植物根际细菌和真菌群落的结构、多样性及功能分化格局。研究人员利用Illumina NovaSeq 6000高通量测序平台，扩增细菌16S rRNA V3–V4区和真菌ITS1区，共获得24个测序文库（7种植物+裸土，各3个重复），并进行生物信息学分析，包括ASV分布、α/β多样性、物种组成及差异富集类群，随后进行功能预测。细菌α多样性（Chao1：623.39–1553.25；Shannon：7.49–9.67）在不同植物种类间差异显著，其中梭罗贝母（Allium przewalskianum，AP）的细菌丰富度和多样性最高（Chao1 = 1553.25 ± 35.89，Shannon = 9.67 ± 0.02）。真菌α多样性也存在显著差异（Chao1：69.66–488.56；Shannon：3.24–4.96），其中金露梅（Dasiphora fruticosa，DF）的真菌多样性最高（Chao1 = 488.56 ± 18.71，Shannon = 7.32 ± 0.06）。在门水平上，变形菌门（Proteobacteria，32.22–50.32%）和放线菌门（Actinobacteriota，15.04–23.19%）是核心细菌类群，子囊菌门（Ascomycota，45.54–96.07%）在真菌群落中占主导地位。PERMANOVA分析确认了不同植物种类间群落组成存在显著差异（细菌：R² = 0.78，p < 0.001；真菌：R² = 0.84，p < 0.001）。不同植物种类与不同的预测功能类群相关联，这些类群可能作为土壤修复的候选生物标志物。然而，所有功能解释均为预测性结果，仍需实验验证。总之，不同原生植物种类的根际微生物群落组成和预测功能谱存在差异，为高寒矿区恢复中植物–微生物协同作用的未来研究提供了相关性证据和候选靶标。

论文解读：高寒矿区优势植物根际微生物群落结构、多样性与功能预测研究

**研究背景与意义**
矿产资源开发是区域社会经济发展的重要支撑，然而高强度、大规模的开采活动容易破坏区域生态平衡，引发土壤结构碎裂、养分耗竭、酸碱失衡、重金属富集及植被退化等一系列生态环境问题，显著降低矿区生态系统的稳定性和自我恢复能力。天祝藏族自治县位于祁连山东端，三大高原交汇形成复杂的大陆性高原气候，区域生态基础敏感脆弱，受损生态系统难以在短期内自然恢复。长期采矿活动形成了典型的退化栖息地，土壤贫瘠化、污染物积累和养分失衡的协同效应进一步阻碍了生态恢复进程。在这种极度退化的栖息地中，自然恢复进程缓慢，因此高效且可持续的人工辅助生态恢复成为高寒矿区生态治理的核心需求。

植被重建和土壤重构是矿区生态恢复的核心内容。与外来物种相比，原生先锋植物因其较强的逆境耐受性，已成为植被恢复的优先材料。天祝矿区通过长期自然演替，形成了若干稳定生长的原生优势植物种群，这些植物不仅能固土保水、防止水土流失，其根系介导的根际微生态系统也是改良退化土壤、激活土壤生物活性、促进生态系统正向演替的核心驱动力。植物与根际微生物保持着密切的共生互作关系，根际微生物可通过养分动员、分泌促生代谢物、降解污染物和增强抗逆性等方式协助植物适应矿区胁迫，因此被视作维持植被定植和群落稳定性的关键生物因子。

然而，天祝矿区独特的寒区气候、地质条件和退化土壤塑造了植物根际微生物群落的独特性，但优势植物与根际微生物之间的协同适应机制及微生物功能分化格局尚不明确。系统分析原生优势植物根际微生物群落的组装特征和功能差异，可推进高寒矿区植物–微生物互作的理论框架，并为矿区生物修复技术的开发提供核心菌株资源和数据支持。高通量测序技术因其高效、准确解析微生物群落结构的优势，已被广泛应用于根际微生态研究，为系统揭示矿区退化土壤微生物多样性和功能特征提供了可靠的技术支撑。

**研究目的与技术方法**
本研究旨在阐明高寒矿区原生植物的根际微生态特征，为矿区植被–微生物联合修复系统的构建和生态恢复策略优化提供科学依据。研究选取天祝高寒矿区共存的7种原生优势植物——火绒草（Leontopodium souliei，LS）、梭罗贝母（Allium przewalskianum，AP）、老芒麦（Elymus sibiricus，ES）、紫花针茅（Stipa przewalskyi，SP）、香青兰（Dracocephalum heterophyllum，DH）、乌拉尔蝇子草（Silene uralensis，SU）和金露梅（Dasiphora fruticosa，DF），并以无植被覆盖的裸土退化土壤（TZ）作为参考样本。

研究采用了以下主要技术方法：（1）基于形态学观察结合DNA条形码技术对7种植物进行物种鉴定；（2）使用MagPure Soil DNA LQ Kit提取土壤总DNA，经NanoDrop 2000分光光度计和琼脂糖凝胶电泳检测质量；（3）利用带条形码标记的特异性引物分别扩增细菌16S rRNA V3–V4区和真菌ITS1区，其中16S rRNA引物为343F/798R，ITS1区引物为ITS1F/ITS2；（4）在Illumina NovaSeq 6000平台进行高通量测序（由上海欧易生物科技有限公司完成）；（5）使用Cutadapt软件（版本4.9）进行序列质控，DADA2算法（版本1.28.0）进行去噪、拼接和嵌合体去除，获得扩增子序列变异体（ASV）；（6）利用QIIME 2软件（版本2023.7）比对Silva数据库（版本138.1，99%相似度）进行物种注释；（7）计算Chao1、ACE、Shannon和Simpson等α多样性指数，采用单因素方差分析或Kruskal–Wallis检验进行组间比较；（8）基于非加权UniFrac距离进行主坐标分析（PCoA）可视化β多样性，并运用PERMANOVA、ANOSIM和PERMDISP检验群落组成差异；（9）采用LEfSe分析（LDA阈值4.0，p < 0.05）筛选差异富集类群；（10）分别使用FAPROTAX和FUNGuild数据库对细菌和真菌群落进行功能预测。

**研究结果**
**ASV分布特征**：不同植物根际土壤和裸土间的细菌和真菌ASV数量存在显著差异。裸土TZ的独有细菌ASV数量高于多数植被样本，表明无植被土壤中细菌组成更具分散性。所有样本共有的核心微生物类群极少，仅检测到44个细菌ASV和9个真菌ASV为所有样本共有，表明植物定植与群落组成差异密切相关，每个样本都表现出较强的特异性，植被类型是与根际微生物物种组成分化相关的关键因素。

**α多样性分析**：所有样本的Good's coverage均大于99%，表明测序深度足以进行多样性估计。细菌α多样性在植物种类间差异显著，AP根际的Chao1和Shannon指数最高（Chao1 = 1553.25 ± 35.89，Shannon = 9.67 ± 0.02）。真菌α多样性在植物种类间也存在显著差异，DF的真菌多样性最高（Chao1 = 488.56 ± 18.71，Shannon = 7.32 ± 0.06，Simpson = 0.99 ± 0.001，ACE = 487.82 ± 24.13）。裸土的总微生物多样性低于大多数植被根际样本。

**β多样性分析**：基于非加权UniFrac距离的主坐标分析显示，前两轴分别解释了细菌（44.31%）和真菌（34.46%）的总方差。ANOSIM分析进一步证实了植物种类间细菌（R = 1.0，p < 0.001）和真菌（R = 0.9388，p < 0.001）群落均存在极显著分离。PERMANOVA确认不同植物种类间群落组成差异显著（细菌：R² = 0.78，p < 0.001；真菌：R² = 0.84，p < 0.001）。PERMDISP检验显示组间多元离散度无显著差异（细菌：p > 0.05；真菌：p > 0.05），表明PERMANOVA结果主要反映的是组间质心差异而非组内变异。

**群落组成与结构**：细菌群落共包含33个门、78个纲、193个目、303个科、531个属和985个种。在门水平上，相对丰度大于1%的类群包括变形菌门（Proteobacteria，32.22–50.32%）、放线菌门（Actinobacteriota，15.04–23.19%）、拟杆菌门（Bacteroidota，7.08–25.39%）、芽单胞菌门（Gemmatimonadota，3.99–26.52%）、粘球菌门（Myxococcota，2.38–4.79%）和酸杆菌门（Acidobacteriota，0.14–4.48%）。变形菌门是绝对优势门，在DF根际相对丰度最高（50.32%），其次是DH（50.10%）。在属水平上，鞘氨醇单胞菌属（Sphingomonas）占优势，其他丰富属包括Ellin6055、黄杆菌属（Flavobacterium）、Flavisolibacter、S0134_terrestrial_group、Massilia和芽单胞菌属（Gemmatimonas）。真菌群落包含11个门、34个纲、77个目、171个科、305个属和355个种。在门水平上，子囊菌门（Ascomycota，45.54–96.07%）占主导地位，其次为担子菌门（Basidiomycota，0.23–46.17%），壶菌门（Chytridiomycota）和球囊菌门（Glomeromycota）检测到的丰度较低。在属水平上，Preussia、Thelebolus、Gibberella和Ampelomyces存在显著差异。总体而言，细菌群落在门水平上的组成高度相似，仅相对丰度存在差异；真菌群落在门和属水平上均表现出更加明显的寄主特异性分化。

**LEfSe差异富集分析**：LEfSe分析显示不同植物种类与不同的生物标志类群相关。LS关联了5个类群，包括Subgroup_7、Rubrobacteriaceae、Lycoperdaceae、Olpidiaceae和Pseudocoleophoma。AP关联了4个类群，包括S0134_terrestrial_group、Gemmatimonas、Xanthobacteraceae和Mortierellales。ES关联了12个类群，包括Streptosporangiaceae、Longimicrobiaceae、Xanthomonadaceae、Micrococcaceae、Flavisolibacter、Hymenobacteraceae、Sporormiaceae、Ceratobasidiaceae、Nectriaceae、Pleosporaceae、Lentitheciaceae和Inocybaceae。SP关联了5个类群，包括Chitinophagaceae、Microscillaceae、Sphingobacteriales、Bolbitiaceae和Agaricaceae。DH富集了14个类群，包括Flavobacteriaceae、Micromonosporaceae、Oxalobacteraceae、Rhizobacter、Rhizobiaceae、Comamonadaceae、Allorhizobium-Neorhizobium-Pararhizobium-Rhizobium、Sandaracinaceae、Longimicrobium、Didymellaceae、Leptosphaeriaceae、Plectosphaerellaceae、Ophiocordycipitaceae和Hypocreales_fam_Incertae_sedis。SU关联了6个类群，包括Novosphingobium、Caulobacteraceae、Gammaproteobacteria、Devosia、Stachybotryaceae和Magnaporthaceae。DF关联了10个类群，包括Sphingomonadaceae、Pseudonocardiaceae、Ellin6055、TRA3_20、Phaeosphaeriaceae、Trichomeriaceae、Helotiaceae、Myxotrichaceae、Orbiliaceae和Chaetosphaeriaceae。TZ以12个类群为特征，包括Gemmatimonadaceae、Acidimicrobiia、Gaiellaceae、Nitrosomonadaceae、Solirubrobacterales、AKAU4049、Thelebolaceae、Mortierellaceae、Dermateaceae、Pezizaceae、Chaetomiaceae和Piskurozymaceae。这些差异类群主要归属于酸杆菌门、放线菌门、芽单胞菌门、变形菌门、拟杆菌门、粘球菌门、担子菌门、油壶菌门、子囊菌门和被孢霉门等核心门类，代表了可能在土壤改良和抗逆性中发挥作用的候选功能群，但其原位功能仍需实验验证。

**功能预测分析**：基于FAPROTAX的细菌功能预测表明，核心细菌功能为化能异养和好氧化能异养，两者相对丰度合计大于50%。化能异养和好氧化能异养相关类群的相对丰度在不同植物种类间存在差异，其中DH根际相对丰度最高，暗示其可能与有机质周转相关。硝酸盐还原和尿素分解等功能在不同物种间丰度各异。植被土壤中动物寄生和病原相关功能类群的相对丰度低于裸土。基于FUNGuild的真菌功能预测将真菌功能群落分为三种营养型：腐生型、共生型和病原型，呈现显著的寄主特异性变化。腐生型是各样本的优势营养型，在LS中相对丰度最高，在DH中最低。共生型在特定物种中相对丰度较高，其中AP显示出最高的菌根真菌丰度，而DH富集了内生真菌。病原型相关功能类群在所有样本中占比低于5%。

**讨论**
高寒矿区遭受高海拔低温、土壤贫瘠、结构退化和长期人为干扰等多重胁迫，生态系统稳定性极差。与人工土壤改良或外源施肥相比，通过原生植物重塑根际微生态、利用植物–微生物协同作用实现土壤自然修复是一种低成本、可持续且具备生态真实性的修复模式。本研究表明根际微生物多样性呈现显著的寄主特异性：AP的细菌多样性最高，DF的真菌优势显著，而DH的整体多样性最低。裸土的微生态结构和功能明显劣于植被根际，表明植被定植对于激活土壤微生物活性和提升多样性具有重要意义。在养分贫瘠的栖息地中，不同植物通过根系分泌物、根际pH和氧化还原电位的差异调控选择性影响功能性微生物群落，建立定制化的根际适应系统。β多样性进一步验证了LS、AP和DF的群落结构相对相似，而DH和SU表现出显著特异性，表明7种植物物种存在分化的微生物招募模式并具有潜在的功能互补性，多物种混播有望实现全面的功能覆盖。

核心群落分析显示，变形菌门、放线菌门和拟杆菌门是核心细菌类群，子囊菌门在真菌中占主导地位，这些被认为是高寒退化土壤中耐受胁迫且生态稳定的土著类群。LEfSe鉴定出的特异生物标志类群呈现不同的富集模式，但应视为统计关联而非功能证明。功能预测提示细菌群落以异养为主，真菌群落以腐生型为主导、共生型为补充、病原型占比极低。根际微生物群共同构成了可能涵盖土壤改良、养分动员、抗逆、促生和微生态净化等功能的综合功能系统。然而，所有功能解释均基于FAPROTAX和FUNGuild预测算法而非直接活性测定，应视为假设生成而非实际生态过程的证据。

**研究结论**
综上所述，本研究系统表征了天祝高寒矿区7种原生植物根际细菌和真菌群落的多样性、组成和预测功能谱。结果表明，根际微生物群落组成在不同植物种类间差异显著，变形菌门、放线菌门和子囊菌门为核心门类。特定类群（如Flavobacteriaceae、Gemmatimonas、Sphingomonadaceae）在不同植物根际差异富集，并与养分循环、逆境耐受和有机质周转等预测功能类别存在统计关联。这些发现为未来机制研究和恢复导向研究提供了基础数据和候选靶标。然而，由于本研究属观察性横断面研究且功能预测尚待实验验证，所观察到的模式为相关性而非因果关系。所提出的植被–微生物联合修复概念应视作受数据启发的假说而非已证实的应用，未来的菌株分离、生理测定和接种实验验证对于任何修复应用都至关重要。