《Microorganisms》：High-Resolution Genomic Profiling of Campylobacter jejuni Across Human, Livestock, and Yellow-Legged Gull Reservoirs in Croatia Reveals Lineage Segregation and Shared Environmental Genotypes
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摘要：溶血性曼海姆菌（Mannheimia haemolytica）是引起牛和羊细菌性肺炎的主要病原体。目前存在多个用于其鉴定的PCR靶标，但尚无广泛采用的标准化引物对。本研究利用临床溶血性曼海姆菌分离株，评估了六对已报道引物（包括rpt2）的通用性。针对常见
摘要：溶血性曼海姆菌（Mannheimia haemolytica）是引起牛和羊细菌性肺炎的主要病原体。目前存在多个用于其鉴定的PCR靶标，但尚无广泛采用的标准化引物对。本研究利用临床溶血性曼海姆菌分离株，评估了六对已报道引物（包括rpt2）的通用性。针对常见反刍动物病原菌/共生菌标准株及其他曼海姆菌属物种进行了属特异性测试。四对引物（gcp、artJ-lktC、lktD、sodA）未能将溶血性曼海姆菌与其他曼海姆菌属物种区分开来。rpt2引物通用性欠佳，22株受试分离株中有3株结果为阴性。rpoB引物具有良好的通用性和特异性，但其136 bp扩增子不适合与溶血性曼海姆菌血清分型引物构建多重PCR。研究人员识别出原始rpt2引物的设计缺陷，并开发了一种新型rpt2-N引物。评估证实其具有良好的通用性、特异性和敏感性，且与血清分型引物兼容，可用于多重PCR检测。对重庆地区三个山羊养殖场的现场测试显示，在气温骤降和运输后，溶血性曼海姆菌阳性率显著升高。血清型A2被确认为重庆地区山羊中的优势血清型。本研究系统评估了多种PCR鉴定引物，证实了rpoB的可行性，并解决了rpt2的通用性局限，为快速准确地检测溶血性曼海姆菌提供了技术支持。
《溶血性曼海姆菌PCR鉴定引物的系统评估与新型rpt2-N引物的开发及应用》论文解读**
一、研究背景与目的
溶血性曼海姆菌（Mannheimia haemolytica），曾命名为溶血性巴斯德菌（Pasteurella haemolytica），属于巴斯德菌科（Pasteurellaceae）曼海姆菌属。该属涵盖多个物种，包括M. haemolytica、M. granulomatis、M. ruminalis、M. succiniciproducens、M. glucosida、M. varigena和M. nigrescens等。作为该属中临床最常见物种，M. haemolytica主要定植于牛、山羊和绵羊等反刍动物的上呼吸道。在病原入侵或不利环境应激导致宿主免疫力下降时，该菌可在体内迅速增殖，是牛呼吸道疾病综合征（BRDC）和绵羊肺炎的主要病原体。近年来，M. haemolytica相关性皱胃炎也被临床描述为羔羊猝死的原因之一。
目前M. haemolytica的鉴定方法主要包括传统病原分离与生化检测、基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）以及基于PCR的分子检测。传统方法依赖选择性培养基上的生长特征、溶血活性、革兰氏染色形态和生化谱进行最终确认，但均需先进行单菌落分离，无法直接检测临床原始样本。PCR检测则既适用于纯化细菌培养物，也适用于组织样本，可实现宿主的快速筛查。然而，M. haemolytica的PCR鉴定尚未建立标准化的分子靶标。已有文献报道的靶基因包括artJ-lktC、rpt2、lktD、rpoB、gcp和sodA等。
针对rpt2基因的引物是区分M. haemolytica分离株最广泛使用的工具，在已发表试验中表现出高特异性。但研究团队在回顾以往发表文献的电泳数据时发现，该引物对无法鉴定某些田间分离株。此外，基于sodA基因的多重PCR虽已建立，但尚未针对定植于小反刍动物上呼吸道的其他曼海姆菌属物种验证其特异性。多个曼海姆菌属物种携带白细胞毒素相关基因（如lktA和lktD）。rpoB分子靶标于2024年新设计，其引物可靠性需进一步评估。artJ-lktC和gcp引物作为鉴定靶标也未被系统评估。
因此，本研究系统比较了六对已报道的M. haemolytica检测PCR引物对的特异性和通用性，重点关注rpt2引物。为解决其通用性不足的问题，研究人员重新设计了rpt2基因的靶区域，进一步验证其特异性和敏感性，并将优化后的引物与已验证的血清分型引物配对开发了多重PCR检测方法。随后，该优化引物被应用于重庆地区多个山羊养殖场和散养群体的M. haemolytica筛查。该研究发表于《Microorganisms》期刊。
二、主要关键技术方法
研究人员采用了多种关键技术方法。在样本来源方面，研究使用了实验室保存的22株M. haemolytica田间分离株（16株源自山羊、6株源自牛，涵盖血清型A1、A2和A6），以及4种其他曼海姆菌属物种和18株常见反刍动物呼吸道病原菌/共生菌标准株用于特异性验证。流行病学调查在重庆地区开展，采用位点级便利抽样策略，从3个集约化养殖场和5个散养群体共采集1836份鼻拭子样本，按环境条件（适宜温度、气温骤降、长途运输）分层采样。方法上，研究对六对已报道引物进行物种特异性测试；基于全基因组测序数据提取rpt2基因序列，利用邻接法（NJ）构建系统发育树；通过序列比对分析基因保守区和可变区，设计新型引物；建立多重PCR体系，将rpt2-N引物与血清分型引物（针对荚膜抗原合成基因hyp、core和tupA）组合；采用Student's t检验进行统计分析。
三、研究结果
3.1 田间分离株的PCR鉴定
利用经测序确认为M. haemolytica的分离株验证六对已报道引物的准确性。结果显示，靶向gcp、rpoB、sodA、artJ-lktC和lktD基因的引物可在全部22株分离株中扩增出相应目标条带，而rpt2基因引物仅在19株中产生目标片段，且不同分离株间扩增子长度存在细微差异。
3.2 引物对近缘菌种的特异性确认
以4种其他曼海姆菌属物种和2株Bibersteinia trehalosi分离株的基因组DNA为模板进行测试。gcp、artJ-lktC、lktD和sodA引物产生了与M. haemolytica阳性对照大小和亮度一致的非特异性扩增产物；而rpt2和rpoB引物对在优化PCR条件下未产生扩增条带，表明二者对近缘菌种具有强特异性。
3.3 扩增效率与非靶标菌特异性确认
针对rpt2和rpoB引物，使用牛源和羊源保存菌株进行进一步验证。两种引物对均表现出稳健的物种特异性，无非靶标扩增。以M. haemolytica基因组DNA为模板时，两种引物对的检测限均为1×10-3 ng/μL。
3.4 rpt2基因的分子特征分析
系统发育分析将M. haemolytica的rpt2基因分为两种基因型。大多数分离株属于以菌株39433为代表的基因型I，仅Mh-21和Mh-23属于以菌株NCTC 10208为代表的基因型II，表明两种基因型之间存在显著分化。序列比对鉴定出该基因内的两个保守区和两个可变区。基因型分化导致可变区A产生序列变异，可变区B的多态性来自不同菌株间GCACA串联重复的长度变化。传统rpt2引物结合于可变区，仅匹配基因型I模板，其反向引物无法与基因型II模板退火，从而限制了检测通用性。新设计的rpt2引物靶向保守区A和B，反向引物结合保守区A，两个正向引物结合可变区B，并在正向引物中引入简并碱基以耐受菌株间碱基错配。
3.5 PCR检测方法的性能评估
对两对新型引物对F1/R和F2/R进行物种特异性评估。F1/R引物对扩增出4条非特异性条带，而F2/R未观察到非特异性产物。F2/R引物成功鉴定所有受试M. haemolytica分离株，产生两种不同大小的rpt2片段：19株产生1067 bp的I型rpt2产物，3株产生911 bp的II型rpt2产物。该特异性引物对命名为rpt2-N。优化后的25 μL PCR反应体系含0.6 μM各正向和反向引物，退火温度为50 °C。该检测方法对M. haemolytica具有特异性，其他曼海姆菌属物种及常见牛羊源细菌均无扩增。基于rpt2-N的PCR检测限为40拷贝/μL。
3.6 多重PCR的构建
利用保守的rpt2-N基因引物和血清型特异性引物建立多重PCR检测方法，可同时鉴定M. haemolytica分离株并确定其血清型。电泳数据显示，所有18株回收的M. haemolytica分离株均产生对应rpt2-N和血清型A2标记基因Core2的特异性扩增产物，验证了该多重PCR检测方法的可靠性。
3.7 临床样本检测
经比较采样部位、DNA提取试剂盒和扩增酶，确定使用商业试剂盒从鼻拭子中提取细菌基因组DNA，配合rTaq DNA聚合酶进行PCR扩增可获得满意的M. haemolytica检出率。所有采集样本随后进行筛查。集约化养殖场山羊的M. haemolytica阳性率中位数约为40%，而散养山羊阳性率显著较低，约为10%（p < 0.0001）。气温骤降应激使所有集约化养殖场的阳性率显著升高至80%以上（p < 0.0001）。运输应激是显著风险因素，长途运输后绵羊阳性率飙升至95.2%（80/84）。
四、讨论与结论
呼吸道疾病严重制约了全球牛、山羊和绵羊养殖业的发展，M. haemolytica是该疾病复合体中的关键病原之一。通过系统评估六对现有鉴定引物对的通用性和特异性，研究发现仅rpt2和rpoB引物能有效区分M. haemolytica与其他曼海姆菌属成员及B. trehalosi。值得注意的是，B. trehalosi最初被分类为M. haemolytica的生物型T，后基于分子证据被重新分类为独立物种，与M. haemolytica系统发育关系密切。既往研究使用gcp引物区分这两种菌，但本研究中gcp引物未能有效区分，由于仅有两株分离株可用，未来需获取更多B. trehalosi分离株进一步评估。
M. haemolytica包含12种已知血清型，其中A1、A2、A6和A7在田间流行病学调查中占主导。为同时实现物种鉴定和血清分型，研究需要扩增子大于500 bp的新型引物对以构建多重PCR体系，确保电泳时与血清分型引物扩增子有效区分。rpoB扩增子仅136 bp，适合用于M. haemolytica定量PCR，但不适合与血清分型引物组合开发多重PCR。因此研究聚焦于rpt2基因本身。BLAST分析显示绝大多数M. haemolytica的rpt2基因为基因型I，仅少数为基因型II，这也解释了既往多项研究中通常仅2至4株疑似分离株无法进行分子鉴定的现象。
尽管M. haemolytica是机会性病原体，研究人员认为分子检测仍然必要。生理条件下，M. haemolytica与其他机会性病原体类似，以低菌量定植于山羊上呼吸道；在特定应激因素存在时，该菌显著增殖并引起宿主临床疾病。常规PCR检测方法灵敏度有限，而基于PCR的阳性检出率可作为评估山羊群健康状态的实际指标。本研究的临床观察初步支持这一观点：气温骤降或长途运输后，M. haemolytica阳性率显著升高；散养群体阳性率远低于集约化圈养群体。此外，本研究建立的多重PCR检测方法确定血清型A2为重庆地区山羊中M. haemolytica的优势流行菌株，为该病原体疫苗开发提供了基础数据。
总体而言，研究人员建立了一种基于rpt2基因的新型M. haemolytica PCR检测方法，解决了既往引物特异性问题，并确认了rpoB引物的可行性。
