《Microorganisms》：A Novel Discovery of Microorganisms Associated with Certain Seaweed Species from the Cat Ba Archipelago Area, Vietnam: Isolation, Identification and Exploration of Their Antimicrobial Activities
编辑推荐：
海洋大型藻类（海藻）是新型天然产物的重要来源，而这些天然产物在许多情况下不仅由藻类自身产生，也由其共生微生物产生。因此，新型产物的搜索不仅应针对藻类本身，还应涉及其共生体。本研究尝试调查从越南吉婆群岛海域采集的9种海洋大型藻类宿主相关的可培养微生物，该区域以显
海洋大型藻类（海藻）是新型天然产物的重要来源，而这些天然产物在许多情况下不仅由藻类自身产生，也由其共生微生物产生。因此，新型产物的搜索不仅应针对藻类本身，还应涉及其共生体。本研究尝试调查从越南吉婆群岛海域采集的9种海洋大型藻类宿主相关的可培养微生物，该区域以显著的生物多样性价值著称。具体而言，研究人员采用标准平板涂布法，使用8种不同营养和盐度条件的培养基分离这些微生物，通过琼脂扩散法和MIC/MBC测定法筛选抗菌活性；对活性最为显著的菌株，基于其形态学、16S rRNA基因序列以及必要时基于持家基因rpoB序列进行鉴定。研究人员共获得331株分离菌株，其中15株细菌分离物对4种测试微生物中的至少1种表现出可检测的抗菌活性。展现出显著抗菌活性的分离菌株主要归属于芽孢杆菌属（Bacillus）物种，同时包括枝芽孢杆菌属（Virgibacillus）、微小杆菌属（Exiguobacterium）、产碱菌属（Alcaligenes）和沙雷氏菌属（Serratia）的代表菌株。有趣的是，这些细菌与海藻宿主的关联几乎均未见报道。在这些分离菌株中，首次发现与红藻宿主脆江蓠（Gelidium crinale）相关的贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）S.002表现出最为显著的抗菌活性，其培养物的乙酸乙酯提取物对枯草芽孢杆菌（B. subtilis）和水稻白叶枯病菌（X. oryzae）均显示出最低的MIC值。该提取物因此被进一步分级分离，对表现出显著抗菌活性的级分采用LC–HRMS进行分析以推定注释其代谢产物。结果表明，除典型的脂肽类化合物外，S.002还能产生若干在贝莱斯芽孢杆菌中鲜有报道的其他代谢产物，包括一些生物碱和一种独特的生物活性氨基酸，这些化合物可能协同贡献于该菌株的抗菌效力。总体而言，研究结果凸显了吉婆群岛大型藻类作为生物活性微生物的潜在来源，而这些微生物反过来又可作为宿主-微生物互作过程中产生的生物活性化合物的潜在来源。
《Microorganisms》论文解读：越南吉婆群岛海藻共生微生物的发现及其抗菌活性研究
一、研究背景与意义
海洋大型藻类（海藻）是沿海生态系统中重要的生境形成型初级生产者，在增强生境复杂性、支撑食物网和贡献海洋初级生产力方面发挥核心作用。海藻能够合成多种结构和生物活性化合物，在农业、化妆品、制药和生物技术领域具有广阔应用前景。海藻的生态表现和实用价值与其共生微生物群落密切相关。海藻共生微生物群包括栖息于藻体表面和组织中的细菌、古菌、真菌、原生生物和病毒等，这些微生物可正向影响大型藻类的形态发生、生长、发育和胁迫耐受性，同时也有助于宿主抵御有害定殖者。宿主与其共生微生物共同构成全生物（holobiont），这是一个通过特殊共生互作维持的整合生态单元。
海藻共生微生物因其产生结构多样的次级代谢产物的能力，日益被视为生物活性化合物的潜在来源。在全球抗菌药物耐药性日益严峻的背景下，海洋微生物（包括与大型藻类相关的微生物）代表了一个有吸引力的抗菌代谢物库。然而，尽管海藻共生微生物具有重要的生态和生物技术意义，基于培养的研究仍然相对有限，且不同宿主类群和地理区域间微生物群分布不均。在越南，关于海藻共生微生物的研究尚处于起步阶段，特别是对吉婆群岛这一具有显著生物多样性价值但研究极为有限的区域，海藻共生微生物的多样性及其抗菌潜力信息严重不足。因此，本研究旨在从越南海防市吉婆群岛海域采集的9种海洋大型藻类宿主中分离可培养微生物，筛选其抗菌活性，鉴定最具潜力的菌株，并初步确定其胞外生物活性代谢物的组成和结构。
二、主要技术方法
研究人员从越南吉婆群岛多个沿海地点手工采集9种海藻样本（包括5种绿藻：Ulva flexuosa、Valonia fastigiata、Caulerpa racemosa、Chaetomorpha linum、Cladophora aokii；4种红藻：Gelidium crinale、Gracilaria tenuistipitata、Dermonema pulvinatum、Centroceras clavulatum），通过表面消毒区分附生和内生微生物，采用8种不同营养和盐度条件的培养基进行分离培养。抗菌活性筛选采用琼脂孔扩散法和MIC/MBC测定法，针对4种测试微生物（Bacillus subtilis、Xanthomonas oryzae、Fusarium oxysporum、Phomopsis asparagi）。菌株鉴定基于形态学观察、16S rRNA基因序列分析，对芽孢杆菌属菌株辅以持家基因rpoB序列分析进行种级鉴定。活性菌株的培养物采用不同有机溶剂（正己烷、乙酸乙酯、二氯甲烷、甲醇）进行萃取，活性粗提物经硅胶柱层析分级分离，活性级分采用LC–HRMS结合GNPS2分子网络平台进行代谢物注释分析。
三、研究结果
3.1 海藻共生微生物的分离
研究人员从9种海藻宿主中共获得331株可培养的附生和内生微生物。其中Gracilaria tenuistipitata获得的菌株数量最多（43株），其次为Ulva flexuosa和Dermonema pulvinatum（各39株）、Valonia fastigiata（38株）、Chaetomorpha linum和Gelidium crinale（各37株）、Centroceras clavulatum（36株）、Caulerpa racemosa（33株）、Cladophora aokii（29株）。所有宿主中细菌分离物占主导，放线菌和真菌占比较小。不同培养基的分离效率存在差异，Marine、LB 3%和YS基础培养基的产菌量普遍高于PDA基础培养基，表明宿主身份和培养条件共同影响海藻共生微生物的可培养性。
3.2 抗菌活性筛选
共15株海藻共生细菌分离物对至少1种测试微生物表现出可检测的抗菌活性。Bacillus subtilis是最敏感的靶标，所有15株分离物均对其有抑制活性，10株对Xanthomonas oryzae有活性，10株对Fusarium oxysporum有活性，6株对Phomopsis asparagi有活性。其中S.002、S.323、S.374、S.467、S.556和S.593能抑制全部4种测试微生物，S.002和S.556表现出最强的抗菌活性和最广的抗菌谱。基于整体抗菌表现，S.002、S.374、S.556和S.593被选为进一步研究的对象。
3.3 活性菌株的形态学和系统发育鉴定
形态学特征结合16S rRNA基因序列分析显示，15株具有显著抗菌活性的细菌分离物归属于5个细菌属。其中11株为革兰氏阳性杆菌，16S rRNA基因与Bacillus物种的同源性超过99%。基于rpoB基因系统发育分析进一步鉴定：S.002、S.467、S.556和S.593为Bacillus velezensis；S.374和S.323为Bacillus amyloliquefaciens；S.051、S.441和S.100为Bacillus stercoris；S.512和S.409为Bacillus subtilis。其余4株分别归属于Virgibacillus、Alcaligenes、Exiguobacterium和Serratia相关参考菌株。结果表明Bacillus相关细菌是海藻共生微生物中抗菌活性的主要来源。
3.4 选定菌株培养物粗提物的抗菌活性
4株选定菌株（S.002、S.374、S.556、S.593）的培养物经正己烷、乙酸乙酯（EtOAc）、二氯甲烷（DCM）和甲醇（MeOH）萃取获得的粗提物表现出明显不同的抗菌谱。所有正己烷提取物均无可检测活性。EtOAc、DCM和MeOH提取物对B. subtilis和X. oryzae表现出抗菌活性，抑制程度因产菌株和萃取方法而异。对X. oryzae的抑制作用普遍更强，S.002的EtOAc提取物活性最强（抑菌圈直径23.50±0.30 mm）。抗真菌活性仅在MeOH提取物中检测到，S.002的MeOH提取物对F. oxysporum和P. asparagi的抑菌圈直径分别为13.00±0.20 mm和14.00±0.30 mm。结果表明萃取方法强烈影响抗菌谱：EtOAc和DCM优先回收抗菌成分，而D101吸附-MeOH洗脱程序额外回收了与抗真菌活性相关的成分。
3.5 活性粗提物的最低抑菌浓度和最低杀菌浓度
MIC和MBC测定结果显示，S.002的EtOAc提取物对两种测试菌均表现出最一致的活性，MIC为6.25 mg/mL，MBC为25 mg/mL。S.002的DCM提取物对两种测试菌的MIC均为12.5 mg/mL。MeOH提取物的抗菌效力普遍低于相应的EtOAc和DCM提取物。所有测试提取物的MBC/MIC比值范围为1至4，表明在实验条件下均表现出杀菌效应而非单纯的抑菌效应。综合来看，S.002的EtOAc提取物表现出最显著且最一致的抗菌特性，对两种靶标细菌均具有最低的MIC值。
3.6 S.002培养物粗提物分级分离后的抗菌活性
S.002的EtOAc粗提物经硅胶柱层析分离获得11个洗脱管，根据TLC相似性合并为4个级分（F1–F4）。抗菌活性测试显示，仅F1和F4表现出可检测的抗菌活性：F1抑制B. subtilis（抑菌圈直径16.5±0.2 mm），F4对X. oryzae有活性（抑菌圈直径19.0±0.3 mm）。F2和F3对两种指示菌均无活性。这表明EtOAc提取物的抗菌活性归因于特定级分而非均匀分布于整个提取物中。
3.7 活性级分的LC–HRMS表征
对活性最强的F4级分进行LC–HRMS分析，初步鉴定出24种化合物，包括环二肽/二酮哌嗪类（如Cyclo(L-Phe-D-Pro)、Cyclo(-His-Pro)等）、环脂肽类（Surfactin A、Surfactin B、Surfactin C、Bacillomycin LC2）、脂氨基酸类（N-tetradecanoylthreonine、N-hexadecanoylserine等）、氧化脂氨基酸类、生物碱类代谢物（Norharmane、Quinoline-4-carboxylic acid）以及氨基酸衍生物（Tryptophan）。其中Surfactin A、Surfactin B、Surfactin C和Bacillomycin LC2属于Bacillus物种中常见的与抗菌活性相关的代谢物类别。多种二酮哌嗪和两亲性脂氨基酸的存在进一步表明该活性级分含有多种类别的生物活性微生物代谢物。这些发现表明活性级分的生物活性可能源于化学多样的肽衍生和脂质相关代谢物的混合物，而非单一化合物。
四、讨论与结论
本研究发现吉婆群岛大型藻类栖息着多样化的可培养微生物群落，331株分离物的数量超过了此前多项培养依赖研究的报道。不同宿主间分离物数量差异显著，表明宿主身份影响可培养微生物的组成。研究首次报道了多种细菌与特定海藻宿主的关联，包括Bacillus velezensis与Gelidium crinale、Bacillus stercoris和Virgibacillus与Ulva flexuosa、Bacillus stercoris、Bacillus velezensis和Alcaligenes与Gracilaria tenuistipitata、Bacillus subtilis、Bacillus stercoris和Serratia与Chaetomorpha linum、Bacillus amyloliquefaciens与Centroceras clavulatum、Bacillus subtilis与Caulerpa racemosa，以及Bacillus velezensis与Valonia fastigiata、Bacillus amyloliquefaciens与Cladophora aokii和Dermonema pulvinatum的首次关联。这些新发现的宿主-微生物关系拓展了对这些海藻共生微生物多样性和功能的认识。
菌株S.002（Bacillus velezensis）表现出最显著的抗菌表型。除典型的B. velezensis脂肽类化合物外，S.002还能产生若干在该物种化学研究中鲜有报道的代谢产物，包括生物碱类（norharmane和quinoline-4-carboxylic acid）和独特的生物活性氨基酸（D-tryptophan）。这些化学性质不同的代谢物的共生产可能拓宽并强化了S.002的抗菌表型，因为norharmane、quinoline-4-carboxylic acid和D-tryptophan本身具有抗菌、抗生物膜或抗毒力活性，可与脂肽类化合物协同增强抗菌效力。S.002的独特之处不仅在于产生典型的B. velezensis脂肽，更在于这些脂肽与一个更为多样的胞外代谢物组合的整合。
本研究证明吉婆群岛海藻栖息着多样化的可培养微生物。331株分离物中，15株具有可检测的抗菌活性，主要归属于Bacillus物种，以及Virgibacillus、Alcaligenes、Exiguobacterium和Serratia的代表菌株。几乎所有细菌与海藻宿主的关联均未见报道。Bacillus velezensis S.002表现出最一致的抗菌活性，其乙酸乙酯提取物对B. subtilis和X. oryzae均具有最低的MIC值。提取物分级分离获得对两种测试菌表现出不同拮抗活性的级分，表明S.002产生多种化学性质不同的抗菌代谢物。这些发现凸显了吉婆群岛大型藻类作为生物活性微生物来源的潜力，并将S.002确定为后续生物测定引导的活性化合物分离纯化、全基因组测序和生物合成基因簇挖掘的优先候选菌株，以阐明其抗菌潜力的遗传基础。
