印楝（*Azadirachta indica*）叶片三菌联合发酵诱导植物化学重塑并增强与雄激素性脱发相关的多靶点生物活性

《Plants》：Tri-Culture Fermentation of Neem (Azadirachta indica) Leaves Induces Phytochemical Remodeling and Enhances Multi-Target Bioactivities Relevant to Androgenetic Alopecia

　　

雄激素性脱发（AGA）涉及二氢睾酮驱动的毛囊微型化，并伴有氧化应激和毛囊周围炎症，而目前的药物治疗仍受限于不良反应。印楝（*Azadirachta indica* A. Juss.，楝科）叶片是一种富含酚类和柠檬苦素类化合物的植物，广泛用于东南亚传统医学。研究人员将印楝叶片与酿酒酵母（*Saccharomyces cerevisiae*）、植物乳杆菌（*Lactobacillus plantarum*）和黑曲霉（*Aspergillus niger*）组成的三菌联合体（TRI-NE）发酵7天，以评估相对于未发酵提取物（UN-NE），微生物多样性的扩大是否能增强生物活性。TRI-NE的总酚含量显著增加，至第7天从315.30 mg GAE/g升至564.70 mg GAE/g，同时所有测定中的抗氧化能力均整体增强。此外，非靶向代谢组学揭示了组成重塑，67.47%的显著变化代谢物特征在发酵后上调，其中槲皮素被选择性富集，尽管其他多酚有所减少。在人毛囊真皮乳头细胞（HFDPCs）及互补模型中，TRI-NE始终优于UN-NE，增强了旁分泌介导的成纤维细胞增殖，在钾通道阻断下维持细胞活力，抑制脂多糖诱导的炎症性一氧化氮产生，并减轻氧化性膜损伤。在转录水平上，TRI-NE下调了雄激素代谢基因（*SRD5A1*和*SRD5A2*）及促退化基因（*TGFB1*），同时上调了Wnt/β-连环蛋白（*CTNNB1*）、音猬因子（*SHH*、*SMO*和*GLI1*）及血管生成（*VEGF*）通路基因，其效果达到或超过标准脱发治疗药物。这些发现表明，TRI-NE比未发酵提取物具有更优越的生物活性，支持其作为AGA多靶点化妆品原料候选物的潜力。

**三菌联合发酵印楝叶：植物化学重塑与雄激素性脱发多靶点生物活性的增强**

**1. 研究背景与科学问题**

雄激素性脱发（androgenetic alopecia, AGA）是全球最常见的进行性脱发类型，其发病率持续上升，对有效且耐受性良好的治疗方案的需求日益迫切。AGA的病理机制复杂，涉及多种因素：循环中的雄激素，特别是二氢睾酮（dihydrotestosterone, DHT），与毛囊真皮乳头细胞（human hair follicle dermal papilla cells, HFDPCs）内的雄激素受体结合，驱动转化生长因子-β1（transforming growth factor beta 1, TGF-β1）介导的凋亡信号，加速毛囊从生长期（anagen）向退行期（catagen）转变；同时，伴随的活性氧（reactive oxygen species, ROS）水平升高引起脂质过氧化，进一步损害HFDPC功能；这些因素共同抑制了毛囊维持生长期所依赖的Wnt/β-连环蛋白-音猬因子（Sonic Hedgehog, SHH）轴和血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor, VEGF）依赖性血管生成。此外，HFDPC作为毛囊周围生态位的旁分泌调节因子，其与成纤维细胞之间的信号通讯在雄激素过量和氧化应激下的失调也被认为是导致毛囊退化的独立因素。

目前AGA的标准药物治疗存在明显局限。非那雄胺（finasteride）和度他雄胺（dutasteride）作为5α-还原酶抑制剂，伴有公认的性和内分泌不良反应，限制了长期依从性；米诺地尔（minoxidil）的效果在停药后大部分逆转，且不能解决毛囊退化的炎症或氧化成分。这一持续的治疗缺口推动了对植物来源、多靶点替代方案的研究，但一个反复出现的限制是：生药提取物的疗效上限往往不取决于原料植物化学的丰富性，而取决于植物基质能使多少内容物以可生物利用的形式释放。微生物发酵被认为是弥合这一可及性差距的直接策略之一。发酵微生物提供植物自身缺乏的酶机制，如糖苷酶、酯酶和酚酸脱羧酶，能够从糖基化或酯化形式中释放酚类和萜类化合物，同时产生未发酵组织中完全不存在的一系列生物活性代谢物，如有机酸、肽和胞外多糖。然而，发酵联合体中微生物多样性的最佳程度，特别是协同效应是否随功能不同微生物的加入而线性扩展，仍未得到充分探索。

在前期研究中，研究人员使用酿酒酵母（*Saccharomyces cerevisiae*）和植物乳杆菌（*Lactobacillus plantarum*）组成的双菌联合体对咖啡果肉进行混合培养发酵，显著增强了与AGA相关的代谢组多样性和生物活性。在此基础上，本研究引入黑曲霉（*Aspergillus niger*）作为第三种微生物，依据是其具有促进植物基质固态发酵过程中植物化学转化、增强酚类回收和抗氧化活性的报道能力，并将所得三菌联合体应用于印楝叶片。由于未包含相应的双菌印楝处理，本实验设计无法直接确定黑曲霉相对于酿酒酵母-植物乳杆菌联合体的增量贡献。选择三种微生物基于文献报道的互补功能：酿酒酵母贡献糖解活性和酵母来源代谢物如β-葡聚糖；植物乳杆菌具有修饰酚类缀合物的酶活性，能诱导发酵植物材料酚类谱的显著变化；黑曲霉广泛用于植物基质固态发酵，能增强酚类和黄酮类化合物的回收与转化并伴随抗氧化活性增加。

印楝（*Azadirachta indica* A. Juss.，楝科）叶片被选为底物，因其是泰国和东南亚大陆的归化物种，广泛作为家常蔬菜食用，是该地区文化嵌入的药用植物。其富含柠檬苦素类和黄酮类化合物，包括印楝素、印楝酚、印楝素、葛杜宁、槲皮素、没食子酸和儿茶素，具有充分记载的抗氧化和抗炎活性。选择印楝的关键原因在于其两大生物活性类别——抗氧化和抗炎——恰好与AGA病理生理的节点相交，发酵驱动的生物利用度增益在这些节点上应能通过机制检测到。由于印楝在未发酵状态下已表现出抗氧化和抗炎活性，它为评估三菌发酵是否能带来超越其固有药理活性的额外生物学益处提供了合适底物。任何对雄激素代谢、旁分泌信号或毛发生长通路的增强调节都将主要归因于发酵诱导的组成变化而非植物本身的固有特性。

**2. 研究目标与主要技术方法**

本研究旨在评估合理设计的三菌发酵系统增强印楝叶片治疗潜力的能力，并通过两条互补路径提供机制见解：（i）植物化学和非靶向代谢组学表征发酵诱导的组成变化；（ii）相关生物活性的机制评估，涵盖HFDPC活力和增殖、HFDPC至成纤维细胞旁分泌信号、ATP敏感钾（K_ATP）通道依赖性HFDPC活力、脂多糖（lipopolysaccharide, LPS）诱导的炎症性一氧化氮产生、氧化应激（细胞内ROS和脂质过氧化）以及与脱发相关的基因表达，包括雄激素代谢（*SRD5A1*和*SRD5A2*）、TGF-β1介导的毛囊退化以及毛发生长通路（Wnt/β-连环蛋白*CTNNB1*、SHH、SMO、GLI1和血管生成VEGF）。

研究采用的主要关键技术方法包括：（1）超声辅助提取（ultrasonic-assisted extraction, UAE）制备乙醇提取物；（2）Folin-Ciocalteu比色法测定总酚含量（total phenolic content, TPC）；（3）DPPH、ABTS和FRAP三种互补的抗氧化活性测定；（4）超高效液相色谱-串联质谱（UHPLC-MS/MS）非靶向代谢组学分析，结合Compound Discoverer软件进行峰检测、比对和注释，注释级别依据Metabolomics Standards Initiative（MSI）分类；（5）高效液相色谱（HPLC）定量分析八种酚类化合物；（6）四种细胞模型的体外实验：HFDPCs（iCell Bioscience Inc.，上海，中国）、RAW 264.7巨噬细胞（ATCC TIB-71）、hTERT永生化成纤维细胞（ATCC CRL-4066）和DU-145人前列腺癌细胞（ATCC HTB-81），使用磺基罗丹明B（sulforhodamine B, SRB）比色法评估细胞毒性、旁分泌介导的成纤维细胞增殖、K_ATP通道阻断下的细胞活力、LPS诱导的NO产生（Griess反应）、H₂O₂诱导的脂质过氧化（TBARS测定）和细胞内ROS积累（H₂DCFDA荧光探针）；（7）半定量RT-PCR分析基因表达。印楝叶片于2025年10月采集自泰国清迈府Mueang区当地市场供应商，标本（PNPRDU68002）由N. Panti鉴定并存放于清迈大学药学院制药与天然产物研究开发部门（PNPRDU）。三种微生物菌株购自泰国科技研究所（TISTR）：酿酒酵母TISTR 5169、植物乳杆菌TISTR 2072和黑曲霉TISTR 3056。

**3. 主要研究结果**

**3.1 植物化学特性与抗氧化性能**

三菌发酵（TRI-NE）显著增强了印楝提取物的总酚含量（TPC），从初始的315.30 mg GAE/g上升至第7天的564.70 mg GAE/g，增幅约79%，而未发酵对照（UN-NE）在7天内无显著时间依赖趋势。与TPC结果一致，TRI-NE的DPPH自由基清除活性（第7天达161.78 mg GAE/g）、ABTS自由基清除活性（第7天达165.94 mg GAE/g）和铁还原抗氧化能力（FRAP，第7天达183.96 μmol Fe²⁺/g提取物）均显著高于UN-NE，且呈时间依赖性增加。结果表明，三菌联合发酵通过微生物水解和生物转化作用，将复杂或缀合酚类化合物释放为低分子量形式，增强了提取物的抗氧化性能。

**3.2 全球代谢组学谱与多变量统计分析**

非靶向代谢组学分析共保留2327个注释代谢物特征。在无统计截断的总体数据集中，61.19%的代谢物在发酵样品中丰度增加，38.76%减少。应用严格显著性过滤（调整后p值<0.01且倍数变化>2或<0.5）后，67.47%的显著变化代谢物上调，32.53%下调。层次聚类分析显示发酵样品与非发酵对照在正负两种电离模式下均清晰分离，表明发酵诱导了显著的代谢转变，以代谢物积累为主要特征。

**3.3 多酚谱分析**

HPLC定量分析显示，UN-NE中绿原酸（15.85±0.12 vs 10.86±0.48 mg/g提取物）、儿茶素（18.55±0.22 vs 16.59±0.25 mg/g提取物）、表儿茶素（4.06±0.11 vs 2.27±0.01 mg/g提取物）和对香豆酸（2.84±0.03 vs 0.10±0.03 mg/g提取物）的含量显著高于TRI-NE；柚皮苷仅在UN-NE中检出。相反，槲皮素含量从UN-NE的10.23±0.75 mg/g提取物显著增加至TRI-NE的15.39±1.97 mg/g提取物，可能归因于微生物酶水解槲皮素糖苷释放苷元。非靶向代谢组学进一步揭示，异阿魏酸、水杨酸、香草酸等酚酸类以及亚油酸、油酸和12(13)-EpOME等脂肪酸/脂质相关代谢物在TRI-NE中显著富集，表明增强的生物活性不太可能仅归因于槲皮素，而是多种发酵来源或生物转化代谢物的集体贡献。

**3.4 细胞培养与细胞毒性评估**

在HFDPCs、hTERT成纤维细胞、RAW 264.7和DU-145细胞中评估了UN-NE和TRI-NE的细胞毒性（0.004-2.000 mg/mL十点稀释系列）。依据ISO 10993-5标准（≥80%活力为非细胞毒性阈值），RAW 264.7和DU-145细胞耐受两种提取物至0.125 mg/mL，而HFDPC和hTERT成纤维细胞活力在0.0625 mg/mL以上低于阈值。因此，0.0625 mg/mL被确定为所有细胞类型和两种提取物的最高非细胞毒性浓度，作为所有下游测定的工作浓度。UN-NE和TRI-NE在所有测试浓度下表现出相当的细胞毒性谱，表明发酵未压缩安全窗口。

**3.5 旁分泌介导的成纤维细胞增殖**

采用条件培养基模型评估HFDPC旁分泌信号对hTERT成纤维细胞增殖的影响。TRI-NE条件培养基达到最高成纤维细胞增殖率（136.17±1.48% of对照），优于UN-NE（127.69±1.93%）和阳性对照米诺地尔（112.74±0.65%）。该活性与发酵过程中槲皮素的积累和总酚含量增加相关，基因表达分析中VEGF和CTNNB1的上调进一步支持这一旁分泌机制。

**3.6 K_ATP相关细胞保护**

使用甲苯磺丁脲（tolbutamide, TBT）作为K_ATP通道药理学阻断剂。TBT单独暴露将HFDPC活力降至对照的67.90±0.40%。TRI-NE将HFDPC活力恢复至94.95±1.46%，显著高于米诺地尔（88.50±1.41%）和UN-NE（86.57±1.23%）。TRI-NE的优越活性不能简单归因于多酚总量增加（其含量低于UN-NE），而可能与其选择性富集的槲皮素（据报道能影响钾通道调节）及发酵产生的额外非多酚还原性化合物（如有机酸和细胞壁降解产物）有关。

**3.7 细胞模型中的抗炎特性**

LPS刺激显著升高HFDPCs（11.83±1.42 μM）和RAW 264.7巨噬细胞（13.04±1.47 μM）的亚硝酸盐水平。TRI-NE表现出最强的亚硝酸盐抑制效果（HFDPCs中2.88±0.08 μM，RAW 264.7中4.78±0.65 μM），显著优于双氯芬酸钠和UN-NE。槲皮素通过抑制NF-κB信号和下调促炎转录通路来抑制iNOS表达和NO产生，可能贡献于TRI-NE增强的抗炎活性。非靶向代谢组学表明67.47%的显著变化代谢物上调，提示发酵来源的低分子量代谢物与槲皮素协同作用。

**3.8 H₂O₂攻击HFDPCs中脂质过氧化的抑制**

H₂O₂暴露显著增加TBARS水平（MDA作为脂质过氧化标志物）。TRI-NE将TBARS水平降至对照的72.18±2.65%，接近L-抗坏血酸的效果，显著优于UN-NE。槲皮素通过嵌入脂质双层并直接清除过氧自由基来中断脂质过氧化传播阶段，这一生物物理机制与NF-κB/iNOS通路互补。细胞-free抗氧化测定与细胞基TBARS结果的一致性表明TRI-NE的体外自由基清除谱成功转化为细胞保护效应。

**3.9 细胞内ROS的抑制**

H₂O₂将细胞内ROS水平升至未处理对照的126.2±4.46%。两种印楝提取物均显著降低ROS水平至对照的85.5±1.86%（TRI-NE）和86.4±1.77%（UN-NE），两者无显著差异，且均低于未处理对照水平。尽管TRI-NE在NO和TBARS测定中表现更强，两者在ROS抑制上的相似性表明细胞内ROS调节并非由单一发酵富集化合物驱动，而是反映多样化代谢物谱的联合效应，包括预先存在的和发酵来源的多种成分。

**3.10 毛发生长基因表达的调节**

在DU-145细胞和HFDPCs中，所有印楝提取物均显著抑制*SRD5A1*和*SRD5A2*表达（p<0.05），TRI-NE表现出最强的抑制效果，分别约为度他雄胺、米诺地尔和非那雄胺的1.20倍、1.65倍和1.75倍。TRI-NE在HFDPCs中对*SRD5A*表达的抑制强于DU-145细胞。对于*TGFB1*（DHT下游促进毛囊退化的介质），TRI-NE显示最大抑制（0.52±0.06倍变化），优于米诺地尔（0.82±0.10）、非那雄胺（0.95±0.08）和度他雄胺（0.96±0.10）。在毛发生长促进通路方面，TRI-NE显著上调*CTNNB1*（1.49±0.04倍）、*SHH*（1.59±0.11倍）、*SMO*（1.73±0.11倍）、*GLI1*（1.81±0.05倍）和*VEGF*（1.29±0.07倍）的表达，其中*CTNNB1*、*SHH*、*SMO*和*GLI1*的上调显著高于UN-NE和标准治疗，VEGF表达与米诺地尔相当。槲皮素被报道能促进β-连环蛋白胞质积累和核转位并刺激音猬因子通路活性，与TRI-NE中槲皮素富集相一致。

**4. 讨论与结论**

讨论部分强调，TRI-NE相对于UN-NE的优越生物活性并非源于多酚总量积累，而是发酵驱动的定性组成转化。尽管TRI-NE中多种定量多酚含量低于UN-NE，但发酵选择性重塑了代谢物谱：槲皮素显著富集，同时非靶向代谢组学显示67.47%的显著变化代谢物上调，包括多种酚酸、脂肪酸和脂质相关代谢物。这些多重变化的代谢物可能通过互补的抗氧化、酶调节和信号通路激活机制协同作用。研究还指出，由于实验未包含双菌对照，无法确定黑曲霉相对于酿酒酵母-植物乳杆菌联合体的增量贡献，未来需要在相同发酵条件下纳入单菌、双菌和三菌处理以区分菌株特异性贡献。

研究结论：三菌联合发酵（酿酒酵母、植物乳杆菌和黑曲霉）产生了化学和功能上不同于未发酵对照（UN-NE）的印楝提取物（TRI-NE）。TRI-NE表现出显著更高的总酚含量和抗氧化能力。此外，TRI-NE诱导了广泛的代谢组重塑，以代谢物积累和槲皮素的选择性富集为主要特征，尽管多种其他定量多酚减少。在细胞模型中，TRI-NE在几乎所有评估终点均优于UN-NE，增强了旁分泌介导的成纤维细胞增殖，在钾通道阻断下保护毛乳头细胞活力，抑制LPS诱导的炎症性一氧化氮产生，并减轻氧化性膜损伤和细胞内ROS。在转录水平上，TRI-NE下调雄激素代谢基因（*SRD5A1*和*SRD5A2*）和促退化基因（*TGFB1*），同时上调Wnt/β-连环蛋白（*CTNNB1*）、音猬因子（*SHH*、*SMO*和*GLI1*）及血管生成（*VEGF*）相关基因，对大多数靶点的活性达到或超过标准脱发治疗药物。这些发现表明，TRI-NE相对于UN-NE的优越生物活性与大量多酚积累无关，而与定性的、发酵驱动的组成转化相关，支持三菌发酵增强印楝功能特性的潜力，并提示三菌发酵可能适用于化学性质不同的植物底物。然而，仍需进一步的机制研究——包括剂量-反应评估以确认观察效果的浓度依赖性、三维（3D）体外毛囊模型和体内评估——以进一步验证TRI-NE作为AGA化妆品原料候选物的治疗潜力。该研究发表于《Plants》期刊。