《Journal of Fungi》：Enhancing Lactate Assimilation in Aspergillus oryzae by Small Amounts of Metabolic Co-Substrates and Low pH
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富含乳酸的副产物和发酵残渣在各种食品和发酵过程中产生，这为通过微生物生物过程将其转化为高价值产品提供了机会。米曲霉（Aspergillus oryzae）因其利用多种底物和生产有价值产物的能力而成为此类应用中有前景的微生物宿主。然而，尽管米曲霉具有工业重要性，
富含乳酸的副产物和发酵残渣在各种食品和发酵过程中产生，这为通过微生物生物过程将其转化为高价值产品提供了机会。米曲霉（Aspergillus oryzae）因其利用多种底物和生产有价值产物的能力而成为此类应用中有前景的微生物宿主。然而，尽管米曲霉具有工业重要性，但其同化乳酸的能力以及限制这一过程的因素仍知之甚少。在本研究中，研究人员调查了米曲霉在乳酸同化过程中的转录响应，并评估了促进这一过程的培养条件。当乳酸作为合成基本培养基中的唯一碳源提供时，米曲霉仅表现出有限的生长和乳酸消耗。转录组分析表明，与碳通量进入三羧酸循环相关的可能代谢限制制约了乳酸同化。为了缓解这些限制，研究人员对培养条件进行了检验。补充少量糖类、特定氨基酸和α-酮戊二酸促进了乳酸同化。此外，低pH条件进一步改善了乳酸同化，将残留乳酸浓度降低至检测限以下。这些发现表明，有效的乳酸同化由少量代谢共底物促进，这可能通过其对中心碳代谢的影响，并结合有利的低pH条件来实现。
论文解读：通过代谢共底物与低pH调控米曲霉乳酸同化机制的研究
一、研究背景与科学问题
食品与发酵工业每年产生大量富含乳酸的副产物和发酵残渣，例如益生菌培养废液、乳制品加工副产物以及乳酸发酵残余物。若将这些废弃物直接排放，不仅增加废水处理成本，还会造成环境负担。因此，开发能够高效利用乳酸作为碳源的微生物转化技术，对于实现废弃物的资源化升级利用具有重要意义。
米曲霉（Aspergillus oryzae）是一种被公认为安全的丝状真菌，长期以来用于传统发酵食品生产。它能够分泌多种胞外酶，利用淀粉、蛋白质等多种食物源组分，并且其基因组信息已完整注释，遗传操作工具也已建立，因此被视为代谢工程和合成生物学研究的理想底盘微生物。然而，此前研究表明米曲霉对乳酸的同化效率极低，即便在酵母提取物（yeast extract, YE）补充条件下，经过96小时培养也仅消耗37.5%的初始乳酸。更为关键的是，限制米曲霉乳酸同化的代谢瓶颈及其调控机制尚不清楚。
基于上述问题，本研究旨在：（1）系统评估米曲霉的乳酸同化能力；（2）通过转录组分析揭示其在乳酸利用过程中的代谢响应；（3）基于转录响应推断可能的代谢限制因素；（4）筛选营养与环境因子，确定促进乳酸同化的最优培养条件。该研究发表于《Journal of Fungi》。
二、关键技术方法
研究人员采用的主要技术方法包括：高通量测序转录组分析（RNA-seq）结合差异表达基因（DEGs）鉴定与京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析；高效液相色谱法（HPLC）定量检测培养液中葡萄糖和乳酸残留浓度；基于核酸含量估算干重法（estimated dry cell weight, EDCW）评估真菌生物量。菌株方面，以米曲霉RIB40野生型菌株（来源于日本国家技术与评价研究所生物资源中心NBRC）为主要实验菌株，并在验证实验中使用了RIB128、RIB143等共计11株其他米曲霉菌株（来源于日本国立酿造研究所）。
三、研究结果
3.1 米曲霉葡萄糖与乳酸代谢的比较
研究人员将RIB40菌株分别在含5 g/L葡萄糖的Glu培养基和含5 g/L乳酸的Lac培养基中培养。结果显示，Glu条件下葡萄糖在48小时内完全消耗，最大EDCW达到3.5±0.1 g/L；而Lac条件下整个培养期内乳酸未被消耗，EDCW增长极为有限，仅形成微小的菌丝聚集体。这表明米曲霉无法以乳酸为唯一碳源进行有效同化。
进一步的RNA-seq分析比较了Glu与Lac条件下的转录谱，共鉴定出3415个DEGs。KEGG富集分析显示，“糖酵解/糖异生”、“丙酮酸代谢”和“乙醛酸和二羧酸代谢”等通路显著富集。具体而言，Lac条件下乳酸转运蛋白JenA/JenB同源基因和L-乳酸脱氢酶（Lldh, K00101）表达上调，而丙酮酸脱氢酶E1β亚基（PdhB, K00162）、E2组分（PdhC, K00627）和丙酮酸脱羧酶（Pdc, K01568）表达下调；同时乙酰辅酶A合成酶（Acs, K01895）、异柠檬酸裂合酶（Icl, K01637）和苹果酸合酶（Mls, K01638）表达上调。研究人员据此提出，乳酸同化的潜在瓶颈可能在于丙酮酸向三羧酸循环（tricarboxylic acid cycle, TCA cycle）的碳通量不足。
3.2 补充糖类对乳酸同化的促进作用
在Lac培养基中添加1 g/L葡萄糖后，培养特征发生显著变化。葡萄糖在早期耗尽后，乳酸消耗开始启动，120小时后约53.1%的初始乳酸被消耗，EDCW达到1.8±0.09 g/L，超过单独使用两种碳源时的EDCW之和，表明消耗的乳酸至少部分贡献于生物量生产。即使仅添加0.2 g/L葡萄糖也能诱导乳酸同化，且消耗程度呈葡萄糖浓度依赖性。此外，α-L-鼠李糖、甘油、蔗糖、D-果糖、D-木糖、淀粉、D-山梨醇和麦芽糖等其他碳源同样能促进乳酸消耗。
在Lac+1 g/L Glu条件下进行的RNA-seq分析显示，与Lac条件相比，pdhB、pdhC和pdc的表达趋于上升，而acs、icl和mls的表达趋于下降，整体表达谱向Glu条件偏移。尽管这些变化未达统计显著性，但表明短暂的葡萄糖暴露可能诱导了一种有利于后续乳酸同化的持续性代谢状态。
3.3 氨基酸对乳酸同化的促进作用
研究人员逐一测试了20种蛋白氨基酸（0.5 g/L）的效果，发现精氨酸、脯氨酸、丙氨酸、酪氨酸和谷氨酸在72小时内使超过40%的初始乳酸被消耗，同时EDCW增加约1.2–1.8 g/L。鉴于精氨酸、脯氨酸和谷氨酸可通过代谢产生α-酮戊二酸（α-ketoglutarate, α-KG）和氨，研究人员进一步测试了α-KG补充的效果。在Lac+0.5 g/L α-KG条件下，120小时内44.4%的初始乳酸被消耗，EDCW达1.6±0.03 g/L，而单独增加硫酸铵浓度效果有限，表明α-KG的作用独立于氮源供应。
3.4 低pH条件对乳酸同化的增强效应
将初始pH调整至3.8后，乳酸同化得到进一步增强。在Lac+1 g/L Glu（pH 3.8）条件下，72小时内乳酸完全消耗，EDCW达3.0±0.2 g/L，较中性pH条件提高1.7倍。在Lac+0.5 g/L Pro和Lac+0.5 g/L α-KG+2×(NH?)?SO?条件下，乳酸均在120小时内完全消耗。此外，使用0.5 g/L YE作为实用替代氮源时，同样实现了乳酸完全消耗。该促进效应在测试的所有12株米曲霉菌株中均得到验证，表明这是米曲霉的共同生理特性。
四、讨论与结论
讨论部分指出，转录组分析虽不能直接反映酶活性和代谢流量，但丙酮酸脱氢酶和丙酮酸脱羧酶相关通路的表达下调暗示，从丙酮酸向TCA循环的碳通量不足以支撑高效生长，而非乳酸摄取本身构成了同化瓶颈。Lac+1 g/L Glu条件下基因表达谱向Glu条件的偏移，提示短暂糖暴露可维持有利于TCA循环碳通量的代谢状态。α-KG补充的实验结果与TCA循环中间体可用性影响乳酸同化的假说一致。低pH条件（接近乳酸pKa值3.86）可能通过增加未解离乳酸比例改善膜通透性和细胞摄取，但这一机制尚需实验验证。
研究结论部分翻译如下：本研究的成果拓展了对米曲霉乳酸利用的理解，并为开发利用乳酸丰富副产物和发酵残渣的生物工艺奠定了基础。这类资源广泛存在于乳品加工、益生菌生产和乳酸发酵等食品与发酵行业，正日益受到微生物升级利用领域的关注。本研究通过确定实现高效乳酸同化的培养条件，拓宽了米曲霉潜在可利用的原料范围。米曲霉作为一种安全微生物，正越来越多地被探索作为食用生物质生产、酶生产及其他增值生物过程的宿主，因此改进的乳酸同化有助于将富含乳酸的资源转化为真菌生物质和其他有价值产物。此外，残余乳酸的高效利用可降低发酵残渣的有机负荷，同时生成有用生物质，从而支持食品副产物价值化和循环生物经济应用的可持续生物工艺发展。
