《Cell Reports》：Mechanistic modeling reveals a configurable AP-1 network governing cell-state heterogeneity and adaptive plasticity in melanoma cells
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AP-1转录因子已被证实参与细胞可塑性、分化状态异质性以及表型转换，从而使肿瘤能够适应抗癌治疗。尽管AP-1状态（由AP-1蛋白的组合表达定义）在细胞群体内存在异质性，但实际观察到的仅是所有可能状态中的一部分。这些状态如何受到约束、为何其分布在不同的细胞群体间
AP-1转录因子已被证实参与细胞可塑性、分化状态异质性以及表型转换，从而使肿瘤能够适应抗癌治疗。尽管AP-1状态（由AP-1蛋白的组合表达定义）在细胞群体内存在异质性，但实际观察到的仅是所有可能状态中的一部分。这些状态如何受到约束、为何其分布在不同的细胞群体间存在差异、以及是什么驱动了这些具有表型后果的状态转换，目前仍不清楚。研究人员建立了一个AP-1网络的机制模型，该模型捕获了依赖于二聚化的、协同调控的以及竞争性的相互作用。通过将模型校准至来自多种黑色素瘤群体的单细胞蛋白测量数据，并结合统计学习，该模型揭示了能够解释群体特异性AP-1状态分布的参数。这些参数与不同细胞群体中的MAPK信号传导相关。该模型预测并通过实验验证了MAPK抑制后的适应性AP-1重配置，该过程驱动一种去分化的、治疗耐药的状态，而通过模型指导的扰动可以减弱这一状态。这些发现确立了AP-1作为一个可配置的网络，并为调控AP-1驱动的细胞状态可塑性提供了一个框架。
论文解读：AP-1网络机制建模揭示黑色素瘤细胞状态异质性与适应性可塑性的调控原理
一、研究背景与科学问题
细胞状态可塑性使得克隆来源的肿瘤细胞能够占据不同的转录和表型状态，并在这些状态之间切换，这对转移侵袭、免疫逃逸和治疗耐药具有重要影响。在黑色素瘤中，肿瘤沿分化轨迹呈现出转录异质性，范围从黑色素细胞样（分化型）到神经嵴样和间充质样（未分化型），这些状态可在同一病灶或患者来源的克隆肿瘤细胞系中以不同频率共存。已有研究表明，这些状态在原发肿瘤生长、转移播散以及对MAP激酶（MAPK）靶向治疗的耐药性方面具有不同倾向。然而，目前对这些表型存在、频率和共存的决定机制，以及它们如何在肿瘤间变化，仍缺乏机制层面的理解。
AP-1转录因子受MAPK信号调控，多次被报道参与肿瘤异质性、细胞可塑性和治疗耐药。尽管以往研究常将AP-1视为单一集合或孤立研究个别蛋白，近期研究已将该家族视为一个协调网络，在单细胞水平上调控黑色素瘤细胞状态异质性。具体而言，AP-1转录因子的相对表达定义了一种“AP-1状态”，可预测遗传背景多样的黑色素瘤群体中的分化异质性；遗传扰动AP-1关键组分可改变AP-1状态分布和相应的黑色素瘤分化状态。然而，产生AP-1状态异质性的机制、MAPK信号如何影响这些机制，以及网络动态特征如何促成状态可塑性，仍不清楚。AP-1蛋白通过bZIP结构域形成同源或异源二聚体，亚基之间竞争有限的结合伴侣，且二聚体可自动和交叉调控AP-1基因表达；ERK、JNK和p38 MAPK则通过转录输入和翻译后磷酸化调节AP-1的基础转录、蛋白稳定性和活性。这种包含竞争、反馈和信号介导调控的分层架构，理论上可产生大量组合空间，但离散的AP-1表达状态如何从中涌现，缺乏整合性机制框架。
二、研究内容与主要结论
研究人员在19株遗传背景不同的黑色素瘤细胞系中，将高多重单细胞测量与机制性单细胞常微分方程（ODE）建模及统计学习相结合，系统探究了AP-1网络。单细胞分析识别出六个反复出现的AP-1状态，这些状态在群体内和群体间的分布并非随机，并与黑色素瘤分化状态密切关联。研究人员开发了一个机制模型，捕获了二聚化控制的竞争性以及自动/交叉调控的AP-1相互作用。经单细胞数据校准后，该模型解释了克隆间和克隆内的AP-1异质性，并将AP-1调控参数与不同黑色素瘤群体间的差异MAPK信号活性联系起来。通过迭代实验和模型分析，研究人员揭示了MAPK通路抑制后AP-1网络的适应性重配置，包括JUND丢失，驱动黑色素瘤细胞从黑色素细胞样状态转向未分化表型——这一转换通常与MAPK抑制剂的适应性耐药相关。该转换由FRA1下调和cJUN上调介导，促进FRA2高表达状态的出现，而该状态在固有未分化的黑色素瘤肿瘤中频率更高。模型预测，cJUN耗竭或FRA1过表达可阻断该转换，实验验证了这一预测。该研究确立了AP-1作为可配置网络，并提供了调控AP-1驱动细胞状态可塑性的框架。
三、主要关键技术方法
本研究使用的主要技术方法包括：1）迭代间接免疫荧光成像（4i）技术，在单细胞水平定量检测19株BRAF突变黑色素瘤细胞系中五种AP-1蛋白、分化标志物（MITF、SOX10、AXL）及MAPK通路磷酸化标志物（p-ERK、p-JNK、p-p38、p-S6）和Ki-67的表达；2）基于常微分方程（ODE）的机制性单细胞计算模型，编码AP-1二聚化动力学、二聚体特异性的自动/交叉调控及竞争性相互作用，并结合拉丁超立方采样（LHS）进行全局参数扫描和模型校准；3）偏最小二乘判别分析（PLS-DA）和变量重要性投影（VIP）用于识别区分不同细胞系、不同AP-1状态以及单稳态/双稳态/三稳态的关键参数；4）单细胞多组学（RNA+ATAC）测序（10x Genomics Multiome）结合加权最近邻（WNN）分析和Leiden聚类，评估JUND敲低对分化状态分布的影响；5）遗传扰动实验，包括shRNA介导的JUND敲低、CRISPR/Cas9介导的JUND和cJUN敲除、FRA1过表达，以及药物处理（vemurafenib、trametinib）。
四、研究结果分述
1. 黑色素瘤细胞在遗传多样群体中表达与分化状态相关的六个反复出现的AP-1状态
通过4i成像和单细胞分析，研究人员在19株细胞系中量化了五种AP-1蛋白的表达，识别出六个反复出现的AP-1状态（定义为至少在3株细胞系中频率>10%）。这些状态在群体间呈现非随机分布：部分克隆系如COLO858、LOXIMVI、WM902B和WM115主要富集于两个状态，而A375、MMACSF和A101D则表现出高度异质性，细胞分布于五到六个状态。不同AP-1状态在分化标志物表达上存在差异，例如状态1（cFOS高/cJUN低/FRA1高/FRA2低/JUND高）的MITF和SOX10水平最高，而状态3（cFOS低/cJUN高/FRA1高/FRA2高/JUND高）的MITF和SOX10最低、AXL最高，与未分化表型一致。此外，不同状态中p-ERK、p-JNK、p-S6和Ki-67水平也存在差异。
2. 计算模型表明二聚化控制的竞争性调控驱动单细胞AP-1异质性
研究人员构建了包含五种AP-1蛋白（cFOS、FRA1、FRA2、cJUN、JUND）二聚化、产生和降解动力学的ODE模型。通过4百万次模拟（200个初始条件×20000个参数集），发现94.3%的参数集收敛到单一稳态，5.5%具有双稳态，0.2%具有三稳态。全局参数扫描揭示，cJUN、FRA1和FRA2的最高表达水平依赖于二聚体介导的诱导产生，而非单纯的基础产生。这表明AP-1网络架构内在支持多稳态，可在相同参数条件下产生不同细胞状态。
3. 校准后的AP-1参数差异解释遗传不同黑色素瘤群体间的AP-1状态多样性
将模型分别对19株细胞系进行校准，通过过滤保留能够重现观察到的AP-1状态（保留或转换）的参数集和初始条件。校准显著缩小了参数空间，例如LOXIMVI仅有不到1%的模拟被保留，而异质性高的MMACSF和A101D保留超过10%。共享的调控配置被分组为15个亚组。PLS-DA比较显示，分化细胞系（WM902B、COLO858）与未分化细胞系（LOXIMVI、WM115）之间的差异主要由cFOS、cJUN、FRA2的基础产生速率（αcFOS、αcJUN、αFRA2）等参数决定。实验测量p-JNK/p-ERK和p-p38/p-ERK比值与模型预测的αcJUN/αcFOS和αFRA2/αcFOS比值一致，支持上游MAPK信号活性差异与AP-1参数差异相关联。
4. AP-1产生和稳定性变异驱动克隆内AP-1状态异质性并与MAPK信号差异一致
针对克隆内共存的AP-1状态对，PLS-DA识别出区分参数：在COLO858中，cFOS高/低亚群主要由αcFOS区分，且cFOS低细胞p-ERK水平显著降低；在WM902B中，FRA1高亚群与较高的αFRA1、JUND-cFOS二聚体诱导的FRA1产生（βFRA1_by_JUNDcFOS）以及较低的FRA1降解率（γFRA1）相关，实验显示FRA1高细胞p-FRA1S265和JUND水平升高；在LOXIMVI中，FRA2高亚群与较高的αFRA2和cJUN-FRA2诱导产生（βFRA2_by_cJUNFRA2）相关，实验显示FRA2高细胞p-p38和cJUN水平升高。
5. 基础产生与二聚体诱导的FRA2产生之间的平衡决定FRA2表达双稳态
全局PLS-DA分析显示，双稳态和三稳态结果与cJUN-cJUN二聚体诱导的cJUN产生（βcJUN_by_cJUNcJUN）增加显著相关。在LOXIMVI中，双稳态与较高的βcJUN_by_cJUNcJUN和βFRA2_by_cJUNFRA2相关，而单稳态FRA2低状态对应于低基础产生和低诱导产生，单稳态FRA2高状态对应于高基础产生。高诱导产生与低基础产生组合时，双稳态使FRA2低和FRA2高状态可在相同参数下共存。
6. ERK抑制后JUND丢失诱导FRA2高状态并通过降低FRA1和升高cJUN促进向未分化表型转换
药物抑制实验显示，部分FRA2低细胞系（COLO858、RVH421、WM2664、A375）在ERK抑制剂处理后出现cJUN和FRA2上调、FRA2高/cJUN高亚群扩增，而另一些FRA2低细胞系（SKMEL5、SKMEL28）则未诱导FRA2且亚群缩小。诱导细胞系均出现JUND和FRA1下调，而非诱导细胞系仅JUND下调、FRA1未下调。在COLO858中通过shRNA敲低或CRISPR敲除JUND，均产生FRA2高亚群，伴随FRA1下调和cJUN上调，并增加SOX10低/MITF低细胞比例。单细胞多组学分析显示JUND敲低后，未分化相关簇C4显著扩增，黑色素细胞样簇C2显著减少。模型模拟预测JUND耗竭可重现FRA2高亚群出现，且PLS-DA提示FRA2高细胞具有更高的cJUN产生速率和更低的FRA1产生/诱导速率。实验验证cJUN敲除或FRA1过表达可显著减少JUND缺失诱导的FRA2高亚群及SOX10低/MITF低细胞比例。
五、讨论与结论总结
讨论部分强调，该研究支持将AP-1视为一个可配置的调控系统，其表型输出由竞争性AP-1二聚体和反馈相互作用之间的定量平衡决定。JUND在分化型黑色素瘤细胞中作为缓冲节点，由ERK信号维持；BRAF/MEK抑制后JUND丢失会重新分配JUN结合伴侣，在FRA1同时降低时促成FRA2诱导。模型还调和了以往对个别AP-1因子功能的矛盾认识，表明其效应取决于控制二聚体形成和输出的定量参数区间。由于AP-1在多种生物学背景和癌症中调控可塑性程序，这些原理可能扩展到黑色素瘤之外。方法上，该工作展示了将高多重单细胞测量、机制性单细胞模型和统计学习相结合的通用框架，可用于跨细胞环境推断调控参数并产生可检验假设。限制性因素包括模型采用确定性ODE、依赖稳态快照而非动态测量、未直接测量二聚体浓度、体外培养环境无法完全模拟肿瘤微环境等。
研究结论翻译如下：这些发现支持一种网络层面的观点，即AP-1是一个可配置的调控系统，其表型输出由竞争性AP-1二聚体及反馈相互作用的定量平衡所设定。在该观点中，由ERK信号维持的JUND在分化型黑色素瘤细胞中充当缓冲节点；BRAF/MEK抑制后其缺失会重新分配JUN结合伴侣，在FRA1同时减少时使FRA2得以诱导。该模型还协调了先前归因于单个AP-1因子的不同作用，表明其效应依赖于决定哪些二聚体形成及其输出驱动功能的定量参数区间（包括伴侣可用性、产生速率和稳定性）。由于AP-1在多种生物学背景和多种癌症中控制可塑性程序，这些原理很可能扩展到黑色素瘤之外，而谱系和突变特异性的差异将决定哪些AP-1组分最具影响力。此外，该研究建立了一个可推广的框架：将高通量多重单细胞测量与机制性单细胞模型和统计学习相结合，以推断不同细胞环境中的调控参数，并通过实验与建模的迭代整合，产生关于特定细胞状态调控及其对扰动反应的可检验假设。
