《Proteomes》：Biological Functions and Applications of Exosomes from Periodontal Ligament Stem Cells
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牙周再生需要重建根骨质、牙周膜和牙槽骨，这些结构常因牙周炎、创伤和其他炎症性疾病而破坏。尽管牙周膜干细胞（periodontal ligament stem cells, PDLSCs）因其多能性、自我更新能力和免疫调节活性而被认为在牙周组织工程中具有前景，但
牙周再生需要重建根骨质、牙周膜和牙槽骨，这些结构常因牙周炎、创伤和其他炎症性疾病而破坏。尽管牙周膜干细胞（periodontal ligament stem cells, PDLSCs）因其多能性、自我更新能力和免疫调节活性而被认为在牙周组织工程中具有前景，但直接的细胞治疗仍面临多种局限性，包括供体变异性、培养相关变化、递送困难和安全问题。因此，来源于PDLSCs的外泌体和小型细胞外囊泡作为PDLSC旁分泌活性的潜在无细胞介质受到关注。PDLSC来源的外泌体携带生物活性分子，包括蛋白质、脂质、信使RNA（messenger RNAs, mRNAs）和微小RNA（microRNAs, miRNAs），并能影响牙周和骨再生环境中受体细胞的行为。体外和临床前动物研究表明，PDLSC来源的外泌体参与成骨、牙周附着修复、牙骨质形成、血管生成、机械传导、细胞增殖/存活和免疫调控。其生物学效应与亲代PDLSCs的状态、其所含货物以及所使用的外泌体分离和表征方法密切相关。本综述总结了关于PDLSC来源外泌体的分离策略、生物学功能和治疗潜力的最新发现，特别关注蛋白质货物、蛋白质组学特征、蛋白质形态相关解释以及miRNA介导的调控。研究人员还讨论了当前在外泌体分离、表征、递送、稳定性和报告标准方面面临的挑战，以用于未来的牙周再生应用。本文讨论的所有发现均为临床前研究，其在临床环境中的应用仍有待探索。
2. 牙周膜干细胞（Periodontal Ligament Stem Cells, PDLSCs）
PDLSCs是位于牙周膜内的定居性克隆源多能祖细胞群。它们在再生牙科中的重要性源于其部位特异性身份。与更通用的间充质干细胞来源不同，PDLSCs直接与牙骨质、牙周膜纤维和牙槽骨的形成、维持和修复相关。这种组织来源使得PDLSCs成为牙周再生中最具功能相关性的牙源性干细胞群体之一。PDLSCs的再生能力得到其在适当条件下进行成骨、成牙骨质、成脂和成纤维分化的潜能支持。基于移植的证据进一步表明，PDLSCs能够在体内促进牙骨质/牙周膜样组织的形成，将其直接与牙周重建而非非特异性的骨修复联系起来。对牙源性干细胞进行的比较蛋白质组学分析也支持这种组织相关特征，显示PDLSCs具有与分化、增殖、细胞外基质组织、炎症和免疫反应相关的细胞和分泌特征。在其天然微环境中，PDLSCs持续暴露于机械负荷、微生物和炎症介质、血管信号以及细胞外基质信号。这些刺激塑造了它们的成骨、免疫调节、血管生成和修复行为。PDLSCs还通过可溶性介质和细胞接触相关机制（包括前列腺素E2相关的免疫调节信号）参与局部免疫-基质调控。这种环境依赖性行为有助于解释为何PDLSC-Exo的货物和功能可能因亲代细胞状态而异。
3. 外泌体生物学与PDLSC来源的外泌体
细胞外囊泡（extracellular vesicles, EVs）是由细胞释放到细胞外环境中的膜结合颗粒。根据其大小、起源和生物发生方式，通常被描述为外泌体、微囊泡或凋亡小体。外泌体通常是直径约30-150nm的小型EVs，通过内吞途径产生，而微囊泡直接从质膜出芽，凋亡小体则来自破碎的凋亡细胞。然而，这些类别在实验制备中并不总是完全可分，因为它们的大小范围、密度和表面标志物可能存在重叠。外泌体携带选定的分子货物，包括蛋白质、脂质、代谢物、mRNAs、miRNAs和其他非编码RNAs。通过将这些分子转移到受体细胞，它们在生理和病理过程中的细胞间通讯中发挥作用。外泌体富集制剂通常通过存在四跨膜蛋白如CD9、CD63和CD81，以及内体或内体分选复合体（endosomal sorting complex required for transport, ESCRT）相关蛋白如TSG101和ALIX来表征。这些标志物支持囊泡富集，但它们并非特定于单一的EV亚型。因此，当前的EV指南建议报告补充的表征数据，包括颗粒大小和浓度、形态、阳性标志物以及细胞污染的阴性对照。
4. 从PDLSCs中分离外泌体
PDLSC-Exo通常从条件培养基或已建立细胞系的血清中获得，因此分析前控制始于培养阶段。血清补充可能引入牛源性囊泡，混淆定量和货物分析，因此许多PDLSC研究使用通过长时间超速离心制备的去除细胞外囊泡的胎牛血清（fetal bovine serum, FBS），或在有限时间窗口内将细胞置于低血清环境中进行条件培养。常见策略包括差速超速离心法、密度梯度超速离心法、尺寸排阻色谱法（size exclusion chromatography, SEC）、超滤法、聚合物沉淀法以及免疫亲和捕获法和微流控平台。这些方法各有优缺点：差速超速离心法适用范围广且产量高，但可能导致囊泡聚集和可溶性蛋白共沉淀；SEC能更好地保持囊泡完整性，适合蛋白质组学应用，但回收率较低；超滤法和聚合物沉淀法操作简单，但纯度不足以进行无偏见的货物分析；免疫亲和法特异性最高，但产量和代表性覆盖度受限。这些权衡为采用组合分离方法而非单一方法提供了依据。对于PDLSC-Exo而言，分离策略应与预期的下游应用保持一致。
5. PDLSCs来源外泌体的功能
体外和体内模型已将PDLSC-Exo与多种生物学功能联系起来。这些功能可分为八个领域：
5.1 成骨与骨重塑： 这是PDLSC-Exo最常被报道的功能之一。在成骨模型中，观察到成骨细胞系活性、碱性磷酸酶活性、矿物质沉积和成骨标志物表达增加。来自成骨诱导的PDLSCs的外泌体比未分化的PDLSCs显示出更强的成骨能力。体内骨缺损研究进一步支持PDLSC-Exo对局部骨修复和成骨样细胞分化的贡献。
5.2 牙周附着修复与牙骨质形成： 在牙周炎相关模型中，局部递送PDLSC-Exo与减少的牙槽骨破坏和改善的牙周修复结果相关。成牙骨质细胞研究也表明PDLSC-Exo可以增强与牙骨质形成和牙周附着修复直接相关的细胞的生物活性。
5.3 细胞增殖、迁移与存活： PDLSC-Exo暴露后，受体成骨细胞样或间充质细胞的增殖和迁移增加。在氧化应激条件下，PDLSC-Exo减少了细胞凋亡并支持细胞存活，同时激活了生存相关的信号通路。
5.4 机械传导与正畸重塑： 机械负荷已被报道会改变外泌体货物和力相关重塑过程中的受体细胞反应。在正畸牙齿移动模型中，张力侧的递送与改善的骨小梁参数和增加的成骨标志物表达相关。
5.5 血管生成与血管支持： 在内皮细胞模型中，PDLSC-Exo增加了管状形成和血管生成标志物的表达；阻断囊泡释放会降低这些血管生成反应。该研究将此效应与外泌体VEGFA转移和miR-17-5p相关调控联系起来。
5.6 免疫调节与炎症调控： PDLSC-Exo的免疫学效应高度依赖于环境。在适应性免疫模型中，PDLSC-Exo通过miRNA相关途径调节Th17/Treg平衡。在巨噬细胞模型中，经LPS预处理的PDLSC小型细胞外囊泡通过TLR2/TLR4/NF-κB相关信号促进炎症性巨噬细胞反应。体内牙周炎研究也报告炎症性PDLSC-Exo可通过促进M1巨噬细胞极化加剧牙周炎症。
5.7 抗菌与药物递送应用： 少数研究将PDLSC-Exo用作递送载体。例如，负载大黄素的PDLSC-Exo在抗菌光动力疗法下降低了致龋菌的细菌活力和生物膜形成；负载曲酸的PDLSC-Exo在抗菌声动力疗法下降低了粪肠球菌的生物膜负荷和毒力基因表达。
5.8 全身性疾病调节与抗癌潜力： 在神经炎症模型中，PDLSC来源的分泌组或外泌体富集组分调节了炎症小体相关的炎症反应。在代谢应激模型中，PDLSC-Exo据报道通过应激适应途径减轻了高血糖相关的衰老。最近，PDLSC-Exo在癌症相关模型中被研究，它们减少了癌细胞生长、集落形成和运动性，并在与奥沙利铂联合使用时增强了化疗敏感性。
6. PDLSCs来源外泌体内部的蛋白质
外泌体蛋白质有两个实际用途。首先，它们用于表征外泌体或小型细胞外囊泡富集制剂。常见的相关蛋白包括四跨膜蛋白CD9、CD63和CD81，以及内体或ESCRT相关蛋白TSG101和ALIX。阴性标志物如钙联蛋白同样重要，有助于评估细胞或内质网污染。其次，外泌体蛋白质可作为生物活性货物。许多报告的PDLSC-Exo货物蛋白是从功能性或阻断实验中推断出来的，而非通过纯化囊泡内的直接蛋白质组学检测确认。VEGFA和ANXA3说明了这一范围。许多在PDLSC-Exo研究中报告的蛋白质更适合解释为受体细胞反应或通路读数，例如成骨蛋白RUNX2、ALP、OCN、OPN、BMP2和BMP4通常反映PDLSC-Exo处理后的分化和矿化，而非囊泡部分内的确认蛋白质货物。
7. PDLSCs来源外泌体内部的MicroRNAs
外泌体miRNAs是连接PDLSCs生物学状态与受体细胞行为的调控性货物分子。骨重塑是PDLSC-Exo miRNAs最具代表性的功能领域。特定的miRNA轴也将PDLSC-Exo与牙周骨修复联系起来，包括miR-31-5p/eNOS、miR-200b/c–Smurf1–BMP/Smad信号和miR-141-3p-KEAP1/NRF2。PDLSC-Exo miRNAs也参与血管和机械适应。PDLSC-Exo miRNAs的免疫调节作用高度依赖于环境。一些miRNA轴减轻炎症并恢复免疫平衡，如miR-205-5p/XBP1和miR-155-5p/SIRT1在Th17/Treg轴中的作用；另一些则可放大疾病或机械应激条件下的炎症反应，包括miR-143-3p–PI3K/AKT/NF-κB、miR-433-3p–TLR2/TLR4/NF-κB和miR-9-5p–SIRT1/NF-κB信号。
8. PDLSCs来源外泌体内部的蛋白质组
PDLSC-Exo的蛋白质组本质上与亲代PDLSCs的生物学状态相关联。亲代PDLSC蛋白质组为此解释提供了第一个生物学背景。分泌组代表了细胞内蛋白质组和外泌体货物之间的下一层。直接对PDLSC-Exo进行的分析支持这种条件依赖的观点。目前仍缺乏完整的PDLSC-Exo蛋白质组图谱。现有证据更多来自供体细胞蛋白质组、条件培养基蛋白质组学和RNA货物分析，而非无偏见的外泌体蛋白质目录。这在一定程度上是因为大多数研究依赖于针对少量预定蛋白（如CD9、CD63、CD81和TSG101）的靶向检测，而非能够无选择地鉴定蛋白质的非靶向蛋白质组学分析。几个因素导致了这一差距：原代PDLSC培养带有显著的个体间差异；培养基引入了进一步的变异性；蛋白质货物谱也随所使用的分离方法而变化。解决这一差距需要在纯化的囊泡部分上直接进行符合报告标准的非靶向蛋白质组学分析，并将原始数据存入公共数据库。
9. 未来展望与改进
PDLSC来源的外泌体和小型细胞外囊泡已在牙周及相关再生模型中被证明与成骨重塑、血管生成支持和免疫调控有关。下一个优先事项是提高分离、测试和声称内容的标准化水平。第二个优先事项是货物水平的定义。未来的工作应将外泌体表征与蛋白质货物分析、蛋白质形态感知解释以及原始组学数据的公共存储相结合。第三个优先事项是可扩展且符合临床要求的制造工艺。递送和稳定性也需要更系统的评估。最后，牙周病学领域的早期临床探索正变得更具可行性。
