《Journal of Oral Microbiology》：Comparative inhibition of oral pathogens, biofilm formation, and inflammation-related responses by postbiotics from Lactobacillus kefiranofaciens DD2
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摘要
背景：源自乳酸菌的后生元作为控制口腔生物膜和炎症的安全、稳定的活菌益生菌替代品，正引起广泛关注。目的：在前期研究鉴定开菲尔乳杆菌DD2（Lactobacillus kefiranofaciens DD2）为强效抗龋菌株的基础上，研究人员比较了DD2产生
摘要
背景：源自乳酸菌的后生元作为控制口腔生物膜和炎症的安全、稳定的活菌益生菌替代品，正引起广泛关注。目的：在前期研究鉴定开菲尔乳杆菌DD2（Lactobacillus kefiranofaciens DD2）为强效抗龋菌株的基础上，研究人员比较了DD2产生的后生元与两株新分离开菲尔菌株（LKF4和LK12）及两株商业益生菌——植物乳杆菌（Lactiplantibacillus plantarum）ATCC 3105和鼠李糖乳杆菌（Lacticaseibacillus rhamnosus）ATCC 7469——产生的后生元的抗菌、抗生物膜和抗炎特性。材料与方法：评估了无细胞后生元对主要口腔病原体（包括变形链球菌（Streptococcus mutans）、远缘链球菌（Streptococcus sobrinus）、牙龈卟啉单胞菌（Porphyromonas gingivalis）和犬牙龈卟啉单胞菌（Porphyromonas gulae））的抗菌和抗生物膜活性。此外，通过一氧化氮（NO）检测和逆转录定量聚合酶链反应（RT-qPCR），在脂多糖（LPS）刺激的RAW 264.7巨噬细胞中研究了其免疫调节作用。结果：所有测试的后生元均显著抑制了病原体的浮游生长和生物膜形成（p?
关键词：乳酸菌；后生元；抗微生物；抗生物膜；抗炎
**论文解读：开菲尔乳杆菌DD2后生元的多功能口腔健康潜力——基于抗菌、抗生物膜及抗炎作用的比较研究**
**一、研究背景与问题提出**
口腔疾病如龋病和牙周炎是由特定细菌病原体驱动的慢性感染性疾病。变形链球菌（Streptococcus mutans）和远缘链球菌（Streptococcus sobrinus）是龋病的主要病原菌，而牙龈卟啉单胞菌（Porphyromonas gingivalis）是与人牙周炎相关的主要病原体。犬牙龈卟啉单胞菌（Porphyromonas gulae）则是犬牙周病中频繁检出的一种主要牙周病原菌，其致病性与生物膜形成及慢性炎症反应的诱导密切相关。这些病原体常定植于牙齿表面的复杂生物膜中，单一使用传统抗菌药物难以根除，因此迫切需要寻找多功能的替代策略。
乳酸菌（LAB）产生的后生元——包括有机酸、胞外多糖（EPS）、多肽和细菌素等生物活性代谢产物——因其安全性和稳定性而成为控制口腔生物膜和炎症的理想候选。与活菌益生菌不同，后生元无需在宿主体内生存或定植，配方更稳健，特别适合口腔局部应用。然而，目前仍存在几个关键问题：第一，对开菲尔来源LAB的研究多集中于致龋链球菌，对牙周病原体如P. gingivalis和P. gulae的评估相对有限；第二，DD2来源的后生元是否优于其他开菲尔来源LAB或广泛使用的商业益生菌菌株尚不明确；第三，LAB后生元对生物膜形成和宿主炎症通路的综合影响缺乏统一实验框架下的系统阐明。因此，本研究旨在比较DD2后生元与其他开菲尔来源及商业LAB菌株后生元在抗口腔病原体、抗生物膜和抗炎方面的活性。
**二、研究设计与技术方法**
研究人员从开菲尔中分离并评估了19株LAB菌株（17株开菲尔来源、2株商业菌株），通过初步抗菌活性筛选，选择5株表现优异的菌株进行深入比较分析，包括开菲尔来源的Lactobacillus kefiranofaciens DD2、Lactobacillus kefiranofaciens LKF4、Lentilactobacillus kefiri LK12，以及商业菌株Lactiplantibacillus plantarum ATCC 3105和Lacticaseibacillus rhamnosus ATCC 7469。商业菌株购自韩国典型菌种保藏中心（KCTC，大田，韩国）。研究分为三个阶段：（1）益生特性与安全性表征；（2）对口腔病原体的抗菌和抗生物膜活性评估；（3）在LPS刺激的RAW 264.7巨噬细胞中的免疫调节作用评价。
主要技术方法包括：通过生长曲线分析评估后生元的抗菌活性；采用结晶紫染色法评估抗生物膜活性；通过WST-8试剂盒检测后生元对人牙龈成纤维细胞（HGF）的细胞毒性以确定最大非细胞毒性浓度；利用Griess试剂检测一氧化氮（NO）产生量；采用逆转录定量聚合酶链反应（RT-qPCR）分析炎症相关基因表达。为确保细胞实验中排除酸性干扰，所有后生元处理均在缓冲培养基（pH 7.0–7.4）中进行。
**三、主要研究结果**
**1. 高效菌株的筛选及其比较益生特性表征**
19株初始LAB菌株中，5株菌（DD2、LKF4、LK12、ATCC 3105和ATCC 7469）对主要口腔病原体表现出优越且一致的生长抑制作用而被优先选择。所有5株菌均显示出96.0–99.9%的16S rRNA基因序列同源性，确认其遗传分类。表型上，所有菌株均表现出γ-溶血（无溶血活性）且无明胶酶活性，满足益生菌应用的基本生物安全要求。酸生成能力方面，所有菌株均具有产酸潜力，但酸化速率存在显著差异。DD2在24小时和48小时均维持显著较高的pH值（分别为4.52±0.01和4.16±0.02），而Lc. rhamnosus ATCC 7469表现出最低pH值（24小时4.07±0.01；48小时3.75±0.02）。大多数菌株能利用蔗糖并在有氧条件下保持高活力，且在α-淀粉酶存在下表现出稳健的稳定性。
**2. LAB后生元对人牙龈成纤维细胞的细胞毒性**
在50%和25%高浓度下，所有LAB后生元均表现出细胞毒性。而在10%和1%浓度下，所有菌株均未观察到细胞毒性，细胞活力值超过80%的安全阈值。
**3. LAB后生元对口腔病原体的抗菌和抗生物膜活性比较**
所有测试的LAB后生元均显著抑制了四种口腔病原体（S. mutans、S. sobrinus、P. gingivalis和P. gulae）的浮游生长。值得注意的是，这种抑制效应延伸至生物膜形成，其中Lact. kefiranofaciens DD2在所有菌株中表现出最强的抑制活性。
**4. LAB后生元对LPS刺激巨噬细胞NO产生的菌株依赖性效应**
所有候选后生元处理24小时未显著降低细胞活力，排除了细胞毒性干扰。NO产生在所有处理策略中均被显著抑制，顺序为：预处理>共处理>后处理。DD2在共处理条件下表现出最显著的抑制效果，在预处理中DD2和LK12将NO水平降低至与空白组相当或更低的水平。
**5. DD2后生元诱导的独特免疫调节基因表达谱**
DD2处理组中促炎介质Cox2、Nos2和Tnf-α的表达显著降低至对照组0.5倍以下，表现出最强的抑制效果。Il-1β表达也显著降低至约0.5倍。转录调节因子p65在所有后生元处理组中均下调。有趣的是，除L. rhamnosus处理组外，Tlr4表达在所有后生元组中显著增加至近4倍。抗炎细胞因子Il-10在所有处理组中呈上升趋势，DD2组表现出最高的诱导水平。抗氧化信号分子Ho-1和Nrf2在所有后生元处理组中均上调。
**四、讨论与结论**
本研究证实了开菲尔来源LAB后生元，特别是Lactobacillus kefiranofaciens DD2产生的后生元，具有与口腔健康相关的多功能生物活性。其抗菌机制可能涉及有机酸降低局部pH和细菌素样物质破坏细胞膜完整性。抗生物膜效应可能通过物理化学改变局部微环境或干扰细菌间相互作用实现。免疫调节方面，DD2后生元在维持Tlr4病原体感知能力的同时，抑制NF-κB相关促炎基因表达并诱导Il-10，表明其促进免疫调节平衡而非全面免疫抑制。Nrf2和Ho-1的上调提示可能的细胞保护通路激活。值得注意的是，由于未包含pH归一化后生元和酸对照，酸度与特定生物活性代谢产物的相对贡献尚需进一步阐明。
研究结论：从开菲尔中分离的乳酸菌产生的后生元，特别是Lactobacillus kefiranofaciens DD2，表现出与口腔健康相关的多功能体外活性，包括抑制口腔病原体和生物膜形成以及调节炎症相关信号。这些发现支持DD2来源后生元作为口腔生物活性剂的候选物。然而，负责这些效应的特定生物活性成分尚未明确，未来研究应结合基于质谱的代谢组学分析等技术来表征后生元组成并鉴定关键活性化合物，同时需要在口腔体内模型中进一步验证其有效性。
