柴胡皂苷B2对猪流行性腹泻病毒体外抗病毒活性的评估

《Viruses》：In Vitro Assessment of Antiviral Activity of Saikosaponin B2 Against Porcine Epidemic Diarrheal Virus

　　

猪流行性腹泻病毒（PEDV）变异株导致疫苗失效并给养猪业造成重大经济损失，凸显了对新型天然小分子抗病毒候选药物的需求。本研究利用基于细胞病变效应（CPE）的细胞保护试验，筛选了一个包含45种小分子的化合物库。源自柴胡（Bupleuri Radix）的三萜皂苷类化合物柴胡皂苷B2（SSB2）脱颖而出，成为最具前景的候选药物，其选择性指数（SI）达19.77，优于大多数天然化合物。剂量反应试验证实了SSB2具有浓度依赖性的抗PEDV活性，在浓度高于60 μmol/L（μM）时抑制作用达到平台期。半数有效浓度（EC50）在CPE抑制与病毒滴度两种读数间存在差异，这一差异通常归因于检测灵敏度的不同。机制研究表明，SSB2不具备直接杀病毒特性；相反，其抗病毒效力依赖于持续给药以抑制病毒的吸附与内化。加药时序实验进一步证明，SSB2能有效抑制病毒早期入侵及中期胞内基因组复制，但不影响病毒释放。值得注意的是，感染后给药比持续给药产生更强的抑制作用，这可能是由于长期暴露扰乱了细胞增殖稳态。此外，SSB2对流行的G2a（JL-06）和G2b（JL-08）田间变异株均保持较强的抑制活性，但对两株变异株的效力均有下降，且对JL-08的抑制作用略弱于JL-06。总体而言，本研究系统表征了SSB2的双阶段抗PEDV特性及其对刺突蛋白突变株的广谱活性，支持SSB2作为开发针对变异PEDV的兽用抗病毒药物的有前景的草药先导化合物。

一、研究背景与意义

猪流行性腹泻（PED）是由猪流行性腹泻病毒（PEDV）引起的一种毁灭性肠道疾病，对全球养猪生产构成严重威胁。作为一种高度传染性病原体，PEDV主要感染新生仔猪，引发呕吐、急性水样腹泻和严重脱水等临床症状。缺乏有效的防控策略时，PED疫情可导致哺乳仔猪极高死亡率，给养猪业造成巨大经济损失。2010年PEDV变异株开始在中国广泛流行，2013年北美和东亚相继出现大规模区域性疫情。PEDV刺突（S）糖蛋白内的连续氨基酸替换驱动了病毒的进化分化并调节病毒感染性。PEDV分离株被分为G1和G2两个主要基因型，其中G2亚型目前在全球田间疫情中占主导地位。基于早期G1毒株研制的常规疫苗只能部分降低疫情风险，而新流行的G2变异株已大大削弱了疫苗诱导的保护性免疫。单一疫苗接种策略无法完全阻断PEDV传播，凸显了对补充性抗病毒治疗药物的迫切需求。

小分子抗病毒药物是PEDV免疫预防的重要辅助手段。合成化合物具有特异性结合病毒靶点和强效快速抗病毒活性的特点，而源自药用植物的天然小分子单体作为替代先导化合物具有独特优势。植物化学单体通常表现出低细胞毒性、低诱导病毒耐药倾向，以及作为低成本起始原料易于获取的优点。然而，目前尚无研究探讨SSB2对PEDV的抗病毒活性，特别是针对流行的G2亚型毒株，这一研究空白限制了SSB2作为PEDV感染防治先导化合物的转化开发。本研究从45种小分子中筛选出SSB2，证明其具有稳健的体外抗PEDV活性，为SSB2应用于PEDV感染治疗提供了理论支持。论文发表于《Viruses》期刊。

二、主要关键技术方法

研究人员采用多种关键技术手段开展研究：利用基于细胞病变效应（CPE）的细胞保护试验对45种小分子化合物库进行初步抗病毒筛选；采用CCK-8法评估化合物细胞毒性并计算20%细胞毒性浓度（CC₂₀）和50%细胞毒性浓度（CC₅₀）；通过半数组织培养感染剂量（TCID₅₀）试验（Reed-Muench法）定量检测感染性子代病毒滴度；运用间接免疫荧光试验（IFA）检测PEDV核衣壳（N）蛋白表达；采用实时荧光定量逆转录PCR（qRT-PCR）定量分析胞内PEDV N基因转录水平；通过蛋白质印迹（Western blot, WB）检测病毒N蛋白表达水平。研究还设计了一系列功能性试验，包括杀病毒试验、共处理、预处理、感染后处理、吸附与内化试验、加药时序试验和病毒释放试验，以阐明SSB2作用的病毒生命周期阶段。PEDV毒株包括CV777原型株以及JL-06/2023（G2a亚型）和JL-08/2023（G2b亚型）田间分离株，均于研究团队实验室分离鉴定。细胞系采用Vero E6细胞。

三、研究结果

3.1 体外抗病毒筛选及候选化合物的选择性指数

研究人员首先确认0.5% DMSO对Vero E6细胞无毒。对全部45种候选化合物进行了细胞毒性谱、CC₂₀和CC₅₀评估。在CPE抑制筛选中，包括姜黄素、柚皮素、莫诺匹拉韦、黄芩素、异甘草素、穿心莲内酯、牛蒡子苷元、硝唑尼特、桦木酸、苦豆碱、大黄素、柠檬苦素、精胺、SSB2、黄腐酚和桦木酮酸在内的16种化合物对PEDV诱导的病变抑制率超过50%。穿心莲内酯、硝唑尼特、SSB2、黄腐酚和桦木酮酸显示出较高的SI值（>5），表明具有较宽的治疗窗口。针对PEDV N蛋白的IFA显示，病毒对照组呈现强烈绿色荧光，而大多数化合物处理组的病毒抗原信号显著降低。TCID₅₀试验定量检测显示，姜黄素、柚皮素、莫诺匹拉韦、硝唑尼特、大黄素、SSB2、桦木酸、苦豆碱、黄芩素和桦木酮酸等化合物显著降低了PEDV滴度。

3.2 所选化合物的剂量依赖性抗PEDV活性

研究人员评估了SSB2在Vero E6细胞中对PEDV的剂量依赖性抗病毒活性。CPE观察和靶向PEDV核衣壳蛋白的IFA显示，SSB2以浓度依赖性方式减轻PEDV诱导的细胞病变并减少病毒N蛋白荧光。TCID₅₀试验证实了SSB2的剂量反应性抗病毒效力，剂量反应曲线确定的EC₅₀为59.80 μM。初步筛选中基于CCK-8细胞活力测定的EC₅₀为11.55 μM，相应SI为19.77，两种EC₅₀的差异归因于检测终点不同。qRT-PCR定量分析显示，从75 μM至150 μM浓度范围内，SSB2显著下调病毒RNA水平。CCK-8细胞活力测定表明，在30至150 μM浓度范围内SSB2对Vero E6细胞无明显细胞毒性。WB分析在蛋白水平上支持了转录水平的发现，SSB2处理逐渐减少病毒N蛋白积累。

3.3 SSB2抑制PEDV感染周期的早期步骤，包括病毒吸附与内化

加药时序试验结果显示，杀病毒、共感染和预感染处理组中PEDV感染性无统计学显著降低，而感染后处理组中SSB2以剂量依赖性方式抑制感染性病毒子代产生。qRT-PCR分析表明，SSB2在共感染或预感染孵育期间不抑制PEDV，但在感染后阶段显著减少病毒RNA积累。吸附和内化试验证实SSB2显著阻碍病毒吸附及随后的内化过程。时间进程动力学实验显示，TCID₅₀滴定在感染后2小时（hpi）即表现出显著抑制，这种剂量依赖性抑制在4和6 hpi时仍然显著，但在10和12 hpi时所有处理组均无统计学抑制效果。而qRT-PCR定量显示，从2至12 hpi期间N基因转录物积累持续受到强烈抑制。专门的释放试验显示病毒释放无显著阻断。这些多阶段功能试验共同证明，SSB2主要通过阻断病毒吸附和内化以及抑制感染后早期胞内N基因转录物积累来对抗PEDV感染。

3.4 针对临床PEDV流行毒株的广谱活性

研究人员用系列稀释的SSB2处理感染两株流行G2亚型PEDV临床分离株JL-06（G2a）和JL-08（G2b）的Vero E6细胞。TCID₅₀试验显示，两株病毒的log₁₀转化滴度均随SSB2浓度增加而逐渐下降，在60和75 μM浓度下观察到感染性病毒滴度的显著降低。RT-qPCR分析表明75 μM SSB2处理后胞内病毒RNA水平显著下降。IFA染色显示在30至75 μM SSB2梯度下PEDV N蛋白荧光信号呈浓度依赖性减弱。WB试验显示两株病毒胞内N蛋白条带丰度随SSB2浓度增加而逐渐下降。箱线图比较显示，在75和60 μM浓度下，SSB2对CV777、JL-06和JL-08三株病毒的抑制效率存在统计学显著差异；在45 μM时，对JL-06和JL-08的抗病毒活性急剧下降；在30 μM时，对JL-06和JL-08的抑制率几乎降至零。这些数据表明，SSB2对G2a和G2b田间分离株均表现出剂量依赖性抗PEDV活性，但在相同浓度下对变异株的抑制效力显著弱于对经典CV777原型株的效果。

四、讨论与结论

讨论部分指出，SSB2的选择性指数为19.77，显著高于大多数阳性化合物，表明其具有良好的生物安全性和较宽的治疗窗口。杀病毒试验证实SSB2不能直接灭活细胞外病毒粒子，区别于可快速破坏冠状病毒脂质包膜的黄酮类衍生物。单次预感染给药未显示保护作用，表明SSB2不能稳定结合细胞表面受体或建立持久的胞内抗病毒状态。吸附和内化试验证实SSB2阻断病毒入侵，但这种抑制活性依赖于化合物的持续暴露，药物洗脱后完全丧失。感染后干预比持续全周期药物孵育产生更强的抗病毒效果，研究人员推测长期SSB2暴露可能破坏宿主细胞增殖稳态，部分抵消其抗病毒效力。加药时序动力学实验表明SSB2的抗病毒能力随药物补充延迟而下降，其核心抑制窗口集中在感染早期。SSB2对两株G2亚型分离株均表现出剂量依赖性抑制活性，病毒基因组突变无法完全逃避SSB2的抑制作用，但JL-08的抑制活性略弱于JL-06，可能源于刺突蛋白关键功能域的不同氨基酸突变。体外有效浓度范围为75至150 μM（针对CV777）和60至75 μM（针对田间分离株），基于小鼠口服SSB2剂量25 mg·kg^?1的理论均匀分布计算估计最大系统浓度约为51.45 μM，但皂苷类口服生物利用度较低，实际血浆浓度预计显著更低，不过胃肠道腔内局部蓄积可能在肠黏膜表面达到60至75 μM阈值。研究存在两个主要局限性：所有抗病毒功能试验均在Vero E6细胞上进行，未能完全模拟PEDV天然感染时的肠道生理微环境；SSB2的直接分子结合靶点尚未鉴定。未来研究将在猪肠道上皮细胞系IPEC-J2上验证SSB2的抗PEDV效力，并通过仔猪攻毒试验评估动物水平的实际保护效果，同时采用分子对接、免疫共沉淀（Co-IP）、表面等离子体共振（SPR）和多组学分析阐明精确的分子调控通路。

研究结论为：SSB2是一种五环三萜皂苷，具有双重抗PEDV作用，既能阻断病毒吸附和内化，又能抑制胞内病毒复制，且对流行田间毒株JL-06和JL-08保持较强抑制活性。因此，SSB2是开发抗PEDV治疗药物的有前景的候选化合物。