《Biology》：Environmental DNA Metabarcoding Reveals Diversity and Spatiotemporal Variations of Benthic Invertebrates in Hun River Basin, China
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淡水生物多样性支撑着生态系统功能与人类福祉。作为淡水生态系统中多样性最高的分类类群，底栖无脊椎动物被广泛用作水生监测与健康评估的生物指示物。本研究采用环境DNA（eDNA）宏条形码技术，揭示了浑河流域（中上游）底栖无脊椎动物的多样性及其时空变化。研究在春季、夏
淡水生物多样性支撑着生态系统功能与人类福祉。作为淡水生态系统中多样性最高的分类类群，底栖无脊椎动物被广泛用作水生监测与健康评估的生物指示物。本研究采用环境DNA（eDNA）宏条形码技术，揭示了浑河流域（中上游）底栖无脊椎动物的多样性及其时空变化。研究在春季、夏季和秋季进行采样，样点布设兼顾了人为活动与流域环境条件。共检出3门、7纲、18目、56科、114属、161种。昆虫纲为优势纲，EPT类群（Ephemeroptera, Plecoptera, Trichoptera）与双翅目合计在春、夏、秋三季分别占总分类单元数的64.71%、74.18%和68.75%。群落组成在季节和空间尺度上均存在变化，这反映在OTU丰富度、优势类群及其相对序列丰度以及α多样性指数上。前10个优势属均为区域常见类群，其中7个属于昆虫纲（包括4个摇蚊科属），而Sulcospira是空间分布最广的优势属。α和β多样性分析显示显著的季节分化，但无显著的空间结构。SIMPER分析确定了各采样组间群落差异贡献显著的关键属。本研究为淡水生物多样性保护提供了基础数据，验证了eDNA宏条形码用于底栖无脊椎动物监测的潜在适用性，同时也揭示了该技术目前的局限性。
淡水生态系统仅覆盖地球表面约0.8%，却承载着超过10%的已知物种，但过去五十年间淡水种群数量骤降超过80%，生物多样性丧失严重。底栖无脊椎动物是淡水生态系统中多样性最高的类群，对营养循环、能量流动和信息传递具有关键作用，且因其生命周期长、分布广、对水质变化敏感，被广泛用作环境监测与水质评估的生物指示物。然而，传统监测依赖形态学鉴定和侵入性物理采样，耗时费力且破坏栖息地，难以满足高精度长期监测需求。环境DNA（eDNA）宏条形码技术结合高通量测序与DNA条形码，可从环境样本（如粪便、分泌物、脱落上皮细胞、配子）中提取遗传物质进行物种鉴定，具有非侵入性、高效、经济等优势，已在多国纳入监测计划。浑河流域是中国北方典型淡水生态系统，历史调查多采用传统拖网和形态学鉴定，普遍存在低丰度类群检出不足、近缘种形态区分困难等问题。因此，研究人员在浑河流域中上游开展本研究，旨在验证eDNA宏条形码技术在该流域底栖无脊椎动物监测中的适用性，明确群落组成和时空变化，识别关键贡献类群。该研究发表于《Biology》期刊。
研究人员在浑河流域中上游（自大伙房水库下游至浑河闸门）设置5个采样点（H1–H5），于2025年春季、夏季和秋季采集水样，每季节-位点组合设3个重复，共45份样品。水样经0.45 μm滤膜过滤后提取DNA，使用通用引物mlCOIintF和dgHCO2198扩增线粒体COI基因片段，并在Illumina NextSeq 2000平台测序。测序数据经质控和97%相似度聚类为操作分类单元（OTU），比对中国淡水大型无脊椎动物条形码数据库（版本2.0，可交叉参考GenBank和BOLD）进行注释。统计方法包括α多样性指数（Richness、Shannon、Simpson、Pielou）计算及非参数检验、β多样性Bray-Curtis距离、非度量多维尺度分析（NMDS）、置换检验（PERMDISP、PERMANOVA）和相似性百分比分析（SIMPER）。
3.1 基于eDNA宏条形码的测序数据总览：测序共获得5,670,390条原始读段，经质控和OTU聚类后得到23,133个OTU，其中161个OTU以97%相似度成功注释到已知物种。为校正测序深度，OTU矩阵被稀释至最小样本量，最终获得48,506条高质量读段。
3.2 底栖无脊椎动物群落分类组成：共检出3门、7纲、18目、56科、114属、161种。节肢动物门占比最大，其次为软体动物门和环节动物门；昆虫纲为最丰富的纲，双翅目贡献最大，摇蚊科为优势科。春季记录11目17科33属，夏季17目47科85属，秋季11目16科29属。夏季多样性最高，EPT类群（蜉蝣目、襀翅目、毛翅目）与双翅目合计占总分类单元数的64.71%–74.18%，其中摇蚊科为三季共同优势类群。
3.3 群落相对丰度与优势属的时空格局：基于OTU相对序列丰度，前10个优势属合计占76.16%，其中Propsilocerus（36.17%）和Stictochironomus（14.00%）占主导。Sulcospira是空间分布最广的优势属，见于11个季节-位点组合。春季以Sulcospira和Polyplectropus为主；夏季群落异质性明显，不同位点优势属不同；秋季Propsilocerus在AUT1–AUT3占绝对优势，但AUT4和AUT5中比例下降。空间上，H2和H3以Propsilocerus为核心优势属，H4和H5以Stictochironomus为核心优势属。
3.4 基于eDNA宏条形码的群落多样性：α多样性分析显示，Richness和Shannon指数存在显著季节变化（p = 0.008和p = 0.049），而空间上无显著差异。β多样性分析中，NMDS排序（stress = 0.06）显示季节间样本明显分离，PERMANOVA表明季节对群落结构有极显著影响（R
2 = 0.3378，p = 0.001），而空间分组不显著（R
2 = 0.250，p = 0.856）。时间β多样性为0.949，空间β多样性为0.899。
3.5 底栖无脊椎动物群落时空变化的贡献属：SIMPER分析表明，季节比较中，Stictochironomus、Propsilocerus、Micropsectra等属对群落差异贡献较大；空间比较中，Propsilocerus和Stictochironomus是主要贡献属。
讨论部分指出，eDNA宏条形码检出的分类单元数超过以往传统调查（如2012年Han等记录48种，2016年Li记录90种，而本研究检获161种），并能检出传统方法易遗漏的仙女虫科、蚤科等类群，同时减少采样偏差和鉴定误差。但该技术也存在引物偏向性（对环节动物、扁形动物等扩增效率低）和参考数据库不完整等局限，导致部分OTU无法完成注释或仅能注释到较高分类阶元。未来需建立系统化长期监测框架，并完善条形码数据库。
研究结论：本研究采用环境DNA（eDNA）宏条形码技术，揭示了浑河流域（中上游）底栖无脊椎动物的多样性与时空变化。共检出3门、7纲、18目、56科、114属、161种。群落组成在季节和空间尺度上均存在变化，这反映在OTU丰富度、优势类群及其相对序列丰度以及α多样性指数上。PERMDISP和PERMANOVA分析显示，季节对群落结构具有极显著影响，而空间分组差异不显著。SIMPER分析识别出对采样组间群落差异贡献显著的关键属，包括Propsilocerus、Stictochironomus、Tanytarsus、Neocaridina等。本研究证实了eDNA宏条形码在典型淡水生态系统（如城市河流）中进行底栖无脊椎动物时空监测的潜在适用性，同时也暴露了该技术应用中的若干局限性。总体而言，本研究为浑河流域水生生物多样性保护和水生态健康评估提供了基础数据，也为改进基于eDNA的水生生物监测方案提供了区域参考案例。
