贝莱斯芽孢杆菌5RB的抗真菌剂：脂肽、聚酮化合物和Subtilosin A的复合作用

《Fermentation》：Antifungal Agents of Bacillus velezensis 5RB: Complex Action of Lipopeptides, Polyketides, and Subtilosin A

　　

贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）因其能产生广谱抗菌代谢物而成为植物病原体生物防治的有前景候选菌株。本研究评估了非致病性根际细菌菌株贝莱斯芽孢杆菌5RB的抗真菌潜力及其代谢谱。通过在三种不同生长培养基（A、B和C）中改变矿物质组成，导致了贝莱斯芽孢杆菌5RB不同的次生代谢物谱。值得注意的是，在培养基A和C中培养的菌株5RB的无细胞上清液对灰霉病病原体灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea）表现出最强的抗真菌活性。研究人员首次利用超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱联用技术（UHPLC-QTOF-MS）全面表征了贝莱斯芽孢杆菌5RB在这三种培养基中产生的抗菌代谢物。质谱分析（LC-ESI-MS）鉴定出主要来自表面活性素（surfactin）和丰原素（fengycin）家族的脂肽，以及三类聚酮化合物：大环内酯类（macrolactins）、二氢杆菌素类（difficidins）和杆菌烯类（bacillaenes）。通过串联质谱法（LC-ESI-MS/MS）确认了多种脂肽同系物，包括一种新的表面活性素亚型（B）。此外，本研究首次提供了贝莱斯芽孢杆菌5RB产生subtilosin A的实验证据。在离体疾病模型中，5RB的多组分发酵基质为番茄叶片抵御灰葡萄孢菌和致病疫霉（Phytophthora infestans*）提供了稳健的生物保护作用，凸显了其在可持续农业应用中的巨大潜力。

贝莱斯芽孢杆菌5RB抗真菌机制与代谢谱系的综合研究解读

1. 研究背景与目的

现代植物保护策略高度依赖化学合成杀菌剂，但其长期使用引发了环境污染、农药残留及病原体抗药性等严峻问题。因此，开发基于有益微生物的环境友好型病害管理方案成为可持续作物保护领域的优先方向。贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）因其能抑制多种植物病原体并促进植物健康而受到广泛关注，其作用机制复杂多样，包括激活宿主免疫、分泌水解酶以及合成多种抗菌次生代谢物。其中，脂肽（如表面活性素surfactin、丰原素fengycin）和聚酮化合物（如大环内酯类macrolactins）被认为是直接抑制病原菌生长的关键因子。然而，菌株的代谢物谱高度依赖于培养条件，且不同代谢物组分的相对贡献尚不明确。此前，研究人员已报道了保加利亚分离株贝莱斯芽孢杆菌5RB的全基因组序列，证实其携带七个完整的聚酮化合物和脂肽生物合成基因簇，但其实际的代谢物谱及各组分对抗真菌活性的具体贡献尚未被探究。因此，本研究旨在定性表征贝莱斯芽孢杆菌5RB在不同培养基下的代谢物谱，并确定哪些抗真菌化合物对其生物防治灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea）和致病疫霉（Phytophthora infestans）至关重要。该论文发表于《Fermentation》期刊。

2. 主要关键技术方法

研究人员采用了以下关键技术：首先，利用超高效液相色谱-电喷雾电离-四极杆飞行时间质谱联用技术（UHPLC-ESI-Q-TOF-MS）对菌株5RB在三种不同矿物组成培养基（A、B、C）中产生的胞外次生代谢物进行全面的定性与相对定量分析。其次，通过电喷雾电离-串联质谱法（LC-ESI-MS/MS）对鉴定的脂肽（特别是新型表面活性素B*亚型）和核糖体合成的sactipeptide（subtilosin A）进行结构确证。此外，结合全基因组挖掘（genome mining）技术，将实验检测到的代谢物与预测的生物合成基因簇（BGCs）进行对应验证。最后，采用反相高效液相色谱（RP-HPLC）分离粗提物中的脂肽组分，并通过刃天青微量滴定板测试评估各组分及无细胞上清液的抗真菌活性。

3. 研究结果

3.1 贝莱斯芽孢杆菌5RB在选定生产培养基中的抗真菌活性

通过对比三种培养基（A、B、C）培养后的无细胞上清液对灰葡萄孢菌的抑制效果发现，培养基A和C在24小时均表现出近完全抑制（>98%），且培养基C在48小时和72小时仍保持最高活性。这表明培养环境的整体矿物平衡显著影响菌株5RB的抗真菌表型和次生代谢物产量。

3.2 贝莱斯芽孢杆菌5RB代谢物组分的质谱表征

3.2.1 次生代谢物的LC-MS谱图分析

LC-MS分析显示，所有提取物中均存在复杂的代谢模式，以表面活性素家族（surfactin）和丰原素家族（fengycin）的脂肽为主，其中表面活性素在保留时间19-27分钟占主导地位。

3.2.2 丰原素类的结构多样性与谱图分析

在培养基A的提取物中鉴定出最丰富的丰原素多样性，主要离子为C17丰原素B（占28.5%）和含单不饱和脂肪酸的C17丰原素A（占19.4%）。培养基C中则以C16丰原素B（相对丰度31.2%）为主导。总体而言，培养基A促进了最高的丰原素总含量和种类多样性。

3.2.3 表面活性素家族脂肽的结构多样性与谱图分析

在所有三种培养基提取物中，表面活性素同系物都是最丰富的代谢物组分。培养基A中以C15表面活性素A和C14表面活性素A丰度最高；培养基C则转向以C16表面活性素A为主导。通过串联质谱分析，研究人员确认了一种新型C14表面活性素B*亚型，其氨基酸序列为Glu¹–Leu/Ile²–Leu³–Leu/Ile⁴–Asp⁵–Leu⁶–Val⁷，此前仅在海洋芽孢杆菌中被报道过。

3.2.4 线性形式的丰原素和表面活性素的鉴定

通过串联质谱分析，研究人员首次在贝莱斯芽孢杆菌的甲醇提取物中确认了四种线性丰原素A和两种线性表面活性素A的存在。

3.2.5 菌株5RB无细胞提取物中聚酮化合物的鉴定

在培养基C的提取物中，鉴定出三类聚酮化合物：大环内酯类（macrolactins，如7-O-琥珀酰基大环内酯A）、二氢杆菌素类（difficidin）和杆菌烯类（bacillaenes）。其中，7-O-琥珀酰基大环内酯A是最丰富的衍生物（占聚酮总峰面积的35%）。

3.2.6 核糖体合成的sactipeptide——Subtilosin A的鉴定

本研究首次通过LC-ESI-MS和串联质谱分析证实，在培养基A和B的培养物中，贝莱斯芽孢杆菌5RB能够产生抗菌sactipeptide——subtilosin A及其变体subtilosin A1。

3.3 贝莱斯芽孢杆菌5RB中生物合成基因簇的基因组挖掘

通过对菌株5RB的草图基因组进行挖掘，研究人员定位了与检测到的代谢物相对应的多个生物合成基因簇（BGCs），包括编码表面活性素（srf）、丰原素（fen）、杆菌烯（bae）、大环内酯、二氢杆菌素、杆菌铁蛋白（bacillibactin）以及推定的subtilosin A/A1的基因簇，从遗传学上支持了代谢物谱的发现。

3.4 选定生产培养基中抗菌代谢物的比较分布

通过比较相对丰度，表面活性素在所有培养基中均为主要家族。培养基A富含脂肽（表面活性素44.3%，丰原素15.5%）；培养基B中subtilosin的相对丰度最高（0.50%）；培养基C则显著富集了聚酮化合物（8.85%）。这表明培养基成分可定向调控代谢流。

3.5 分离脂肽组分对灰葡萄孢菌的抗真菌活性

从培养基C提取物中分离出的富含丰原素的组分I和富含表面活性素的组分II，其对灰葡萄孢菌的最大抑制率分别为53.55%和36.65%。相比之下，未分级的总无细胞上清液在24小时达到98.3%的抑制率，表明不同代谢物类别之间存在显著的协同增效作用。

3.6 贝莱斯芽孢杆菌5RB发酵液对灰葡萄孢菌和致病疫霉的离体生物防治活性

在离体番茄叶片模型中，经菌株5RB全发酵液预处理的叶片在接种灰葡萄孢菌和致病疫霉后，病斑发展被显著抑制，仅出现微小局部坏死斑点，而未处理对照组则出现大面积扩展性坏死和叶片萎蔫。这证明了发酵液（包含代谢物和活菌）的强大保护潜力。

4. 讨论与结论

讨论部分指出，本研究首次精确地定性了贝莱斯芽孢杆菌5RB产生的胞外抗菌代谢物谱，揭示了其通过非核糖体和核糖体途径合成的丰富多样的化合物，包括大量脂肽、四种大环内酯类似物、杆菌烯、二氢杆菌素以及sactipeptide subtilosin A/A1。研究发现，培养基中微小的矿物组成变化即可将次生代谢重定向至不同类别的生物活性化合物，从而调节非核糖体肽合成酶（NRPS）和聚酮合酶（PKS）合成代谢物之间的平衡。例如，培养基A有利于脂肽多样性，培养基B促进了subtilosin的产生，而培养基C则显著增加了聚酮化合物的产量。这种代谢物的组合效应解释了为何未分级的上清液比单一分离组分具有更强的抗真菌活性，因为丰原素破坏真菌膜，表面活性素增强膜通透性，而subtilosin和聚酮化合物则贡献了额外的抗菌机制。

研究结论翻译如下：

本研究表明，贝莱斯芽孢杆菌5RB产生了显著多样的抗真菌代谢物库，其组成可以通过培养介质进行选择性调控。全面的UHPLC-QqTOF-MS/MS分析鉴定了众多表面活性素和丰原素同系物、几种聚酮化合物，并且首次在贝莱斯芽孢杆菌中发现了sactipeptide subtilosin A/A1。此外，研究人员还表征了一个先前未被描述的C14表面活性素B*亚型和几种线性丰原素同系物，扩展了该物种已知的抗菌代谢物化学多样性。总体而言，研究结果表明，通过修改培养基以富集特定的生物活性化合物，可以战略性地指导贝莱斯芽孢杆菌5RB的次生代谢。先进的基因组挖掘有效地绘制了负责这一多样化化学谱的非核糖体和核糖体生物合成途径（NRPS、PKS和RiPP）。我们的代谢谱分析、遗传预测和初步离体生物保护试验之间的显著一致性证实，5RB分离株是开发多靶点生物杀菌剂的有前景候选者。然而，需要在温室和田间环境下对完整植株进行进一步研究，以全面评估其生物防治功效、持久性和在农业生产中的实际应用。