《iScience》：Single-cell gene regulatory networks characterize colonic stem and immune cell homeostasis in Nr4a1 knockout mice
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最近的发现表明，孤儿核受体4A（NR4A）能够调节细胞能量代谢和上皮防御功能，从而有助于形成具有抵抗力的抗病表型。为进一步研究NR4A对肠道上皮细胞、基质细胞和免疫细胞稳态的影响，研究人员在野生型和全身性Nr4a1基因敲除小鼠中进行了单细胞转录组学分析和差异基
最近的发现表明，孤儿核受体4A（NR4A）能够调节细胞能量代谢和上皮防御功能，从而有助于形成具有抵抗力的抗病表型。为进一步研究NR4A对肠道上皮细胞、基质细胞和免疫细胞稳态的影响，研究人员在野生型和全身性Nr4a1基因敲除小鼠中进行了单细胞转录组学分析和差异基因网络分析。在此，研究人员观察到Nr4a1缺失对涉及肠道干细胞、巨噬细胞、T细胞和B细胞以及成纤维细胞的细胞间通讯产生了广泛影响，表明结肠上皮和免疫微环境及其调控网络发生了复杂而广泛的重塑。这种细胞间串扰的改变与单细胞熵升高和结肠隐窝来源类器官生长增加相关联，表明上皮细胞具有更高的分化潜能和干细胞样特性。本研究证实Nr4a1在结肠干细胞和免疫稳态中作为关键调控因子发挥作用。
论文解读：Nr4a1基因敲除对结肠干细胞与免疫细胞稳态的单细胞基因调控网络影响
**一、研究背景与科学问题**
孤儿核受体4A（NR4A）家族属于核受体超家族中的转录因子亚家族，包含NR4A1（Nur77）、NR4A2（Nurr1）和NR4A3（Nor1）三个成员。由于其内源性配体尚未被鉴定，这些受体被指定为孤儿受体。NR4A家族成员是受应激和炎症诱导的即刻早期基因，在调节细胞稳态和病理生理过程中发挥关键作用。已有大量证据表明，NR4A1在多种实体瘤中过表达，且对多种肿瘤类型而言，NR4A1是患者生存的负性预后因素，显示其具有促癌活性。然而，在Nr4a1基因敲除小鼠（Nr4a1-KO）中的多项研究表明，Nr4a1缺失会增加不良反应通路和基因发育的易感性。重要的是，Nr4a1已被鉴定为肠道中经典Wnt信号通路的负调控因子；Nr4a1缺失导致Wnt通路激活增强和肠道肿瘤发生增加，凸显了其在维持上皮稳态中的保护作用。此外，Nur77通过多种机制在肠黏膜中发挥保护性抗炎作用，包括抑制巨噬细胞和上皮细胞中的NF-κB信号传导、维持上皮屏障完整性等。然而，NR4A对与不同上皮和免疫反应相关的细胞亚群的影响仍不完全清楚。
**二、研究目的与主要发现**
为进一步阐明Nur77在调节肠道隐窝稳态中的作用，本研究利用单细胞转录组学分析确定了野生型（WT）和全身性Nr4a1-KO小鼠结肠黏膜干细胞和免疫细胞的变化。研究发现，Nr4a1缺失对结肠上皮和免疫微环境及其调控网络产生了广泛影响。主要发现包括：Nr4a1敲除提升了结肠干细胞分化潜能；Nr4a1缺失改变了免疫细胞群体的转录变异性；网络分析揭示了Nr4a1缺陷干细胞中Wnt通路的重新布线；结肠类器官生长实验证实了Nr4a1-KO小鼠增强的上皮干性。研究结果支持Nr4a1在肠道中的保护作用，并证明Nr4a1在结肠干细胞和免疫稳态中作为关键调控因子发挥作用。该研究发表在《iScience》期刊。
**三、关键技术与方法**
研究人员主要采用了以下关键技术方法：利用10× Genomics Chromium Fixed RNA Kit构建单细胞RNA测序（scRNA-seq）文库，并在NovaSeq 6000平台上进行测序；使用Cell Ranger、Seurat和scGEAToolbox进行数据预处理、质量控制和细胞类型注释；应用Spline-DV方法进行差异变异性（DV）分析，使用Wilcoxon秩和检验进行差异表达（DE）分析；利用CCAT（Connectome和Transcriptome的相关性）方法估计单细胞分化潜能；使用scTenifoldNet进行差异调控（DR）分析和基因调控网络（GRN）推断；采用CellChat 2.0进行细胞间通讯分析。样本来自C57BL/6背景的全身性Nr4a1基因敲除小鼠（n=4）和年龄匹配的野生型对照小鼠（n=4），结肠隐窝来源类器官培养使用另一批独立的小鼠（WT n=5，Nr4a1 KO n=4）。
**四、主要研究结果**
**1. Nr4a1敲除的验证与单细胞图谱构建**
通过实时PCR验证了Nr4a1在KO小鼠结肠和肝脏中的表达缺失，而Nr4a2表达不受影响。研究人员构建了包含平滑肌细胞（SMCs）、结肠细胞、血管内皮细胞（VECs）、淋巴管内皮细胞（LECs）、肠胶质细胞（EGCs）、肠神经元（ENs）、成纤维细胞、巨噬细胞、先天淋巴细胞（ILCs）、肥大细胞、NK细胞、T细胞、浆B细胞和B细胞等主要细胞群体的全面单细胞图谱。通过UMAP可视化和外显子水平分析（外显子3和5）证实了高效靶向缺失。
**2. Nr4a1缺失对细胞群体丰度和分化潜能的影响**
Nr4a1敲除导致多种细胞类型（包括结肠细胞、B细胞、浆B细胞、成纤维细胞、巨噬细胞和SMCs）的单细胞分化潜能评分显著升高，表明这些谱系中Nr4a1的缺失导致细胞向更不分化、更具“干细胞样”或可塑性的状态转变。相反，KO肥大细胞表现出显著的分化潜能降低。
**3. 结肠细胞亚型分析**
对结肠细胞亚群的分析显示，尽管细胞比例没有显著变化，但Nr4a1缺失显著改变了干细胞、深隐窝分泌（DCS）细胞、杯状细胞和吸收性结肠细胞的分化潜能。功能验证实验表明，Nr4a1-KO小鼠结肠隐窝来源的类器官数量显著增加。细胞周期分析显示，Nr4a1-KO干细胞S期评分显著降低，提示干细胞向静息但具有高自我更新潜能的“预激活”状态转变。
**4. 基因调控网络分析揭示Wnt信号通路重塑**
通过scTenifoldNet的DR分析和GRN推断发现，在WT干细胞中Nr4a1作为主要调控节点，与Jun、Fzd7和Ascl2等核心Wnt组分维持负共调控关系。Nr4a1缺失后，Nr4a3从稀疏状态转变为广泛活跃的枢纽，与Axin2和Fzd7建立新的负调控，同时正向调控Sox9。Apc也从WT网络中几乎不活跃的状态变为KO中的显著参与者。
**5. T细胞亚型分析**
Nr4a1敲除导致T细胞总数减少，DN和CD8+ T细胞比例降低，而循环T细胞、CD4+ T细胞和Tregs比例增加。CD8+ T细胞的GRN分析显示，Nr4a1缺失后，Nr4a2被高度整合，与Eomes、Runx3、Il4ra和Ppp3cb建立新的正调控连接，同时与Irf4和Tbx21形成负共调控。Nr4a3的调控极性发生翻转，与Bach2、Mgat5和Kdm5a形成强正协同。
**6. B细胞和浆B细胞分析**
Nr4a1-KO结肠B细胞表现出增强的活化、趋化和体液免疫特征，包括免疫球蛋白基因上调和B细胞趋化因子Cxcl13表达增加。浆B细胞显示内质网（ER）功能受损，包括ERAD通路和MHC I类蛋白复合物组装通路下调。
**7. 巨噬细胞分析**
Nr4a1-KO巨噬细胞呈现促炎和免疫活化基因上调（如Ccl8、Gbp2、Ifitm1），但同时抗菌防御相关通路（如对细菌的防御反应）显著下调，表明巨噬细胞处于一种功能失调状态。
**8. 成纤维细胞分析**
Nr4a1-KO成纤维细胞表现出向免疫应答和促炎表型重编程的特征，包括免疫球蛋白基因和MHC II类基因上调，同时细胞外基质（ECM）组织和超分子纤维组织相关通路下调。
**9. 细胞间通讯分析**
CellChat分析显示，Nr4a1-KO小鼠结肠干细胞和CD8+ T细胞作为信号源与多种细胞类型的相互作用显著增加，涉及MHC相关分子、Ceacam1、Sema4D和TGF-β信号通路。成纤维细胞也表现出增加的MHC相关信号传导和ECM介导的通讯。
**五、讨论与结论**
研究表明，全身性Nr4a1缺失诱导结肠干细胞和分化的上皮细胞中单细胞熵广泛升高，提示Nr4a1直接调控已分化细胞去分化为干细胞的能力。从机制上讲，GRN分析显示Nr4a1在WT小鼠中与介导干性的Wnt通路基因负共调控，而这种连接在KO小鼠中丢失。研究还观察到多个细胞群体中广泛的促炎转录程序，以及上皮屏障功能障碍的转录变化。Nr4a1-KO结肠中B细胞和浆B细胞群体的扩张可能通过抑制黏膜修复而发挥作用。研究的局限性在于使用全身性敲除模型无法将观察到的变化完全归因于特定细胞类型中Nr4a1的细胞自主性缺失，需要未来使用条件性、细胞类型特异性敲除模型进行研究。综上所述，Nr4a1在调节结肠上皮干细胞、基质细胞和免疫细胞稳态以及细胞通讯中发挥关键作用，其缺失可能使宿主易患炎症或癌症相关后遗症。
