点突变是最常见且临床重要的遗传变异形式之一。它们与许多遗传性疾病和癌症的发生和发展密切相关，因此其检测对分子诊断、疾病分层、预后评估和精准治疗具有重要意义[1], [2]。例如，JAK2 V617F是骨髓增殖性肿瘤的关键分子标志物，被广泛用于疾病诊断、分类和治疗监测[3], [4]。然而，准确的点突变分析仍然具有挑战性，因为突变型和野生型等位基因仅相差一个核苷酸，需要严格的序列区分才能实现可靠的突变检测和定量突变分数分析。
为满足这些分析要求，已开发了多种突变分析策略，包括测序、基于扩增的检测以及酶辅助的核酸识别方法[5]。测序，特别是下一代测序（NGS），提供了全面的遗传信息，已成为基因组表征的金标准[6], [7]。然而，其高昂的成本、复杂的流程以及对专门仪器和经过培训的人员的依赖限制了其在已知突变分析中的常规使用。相比之下，基于扩增的检测非常适合已知突变的常规分析[8], [9], [10], [11]。然而，对于单一碱基突变，仅靠聚合酶介导的识别往往不足以实现严格的突变/野生型区分。为克服这一局限性，已广泛引入额外的酶识别来增强序列选择性。代表性示例包括序列特异性探针识别[12], [13]、核酸酶辅助识别[14], [15], [16], [17]、flap核酸内切酶介导的识别[18], [19]和连接酶介导的识别[20], [21]。
连接酶链式反应（LCR）依赖于DNA连接的高度序列依赖性，即只有当相邻探针在连接位点完全匹配时才发生有效连接，从而实现高度特异的单碱基突变区分[22], [23], [24]。间隙连接酶链式反应（Gap-LCR）进一步在相邻探针之间引入了一个短间隙，允许聚合酶介导的间隙填补后再进行连接，从而提供了额外的序列依赖性控制[25]。这种设计减少了由靶标无关的平末端连接产生的背景信号，同时利用了聚合酶延伸和连接的综合特异性，从而能够在大量野生型背景中检测到突变DNA。尽管如此，Gap-LCR产物的检测在很大程度上仍依赖于终点测量、间接信号转换或多步骤分析程序[25], [26], [27], [28], [29]，这些方法需要扩增后处理，从而增加了操作复杂性和污染风险。尽管已经报道了一种实时Gap-LCR实施方案[30]，但在封闭单管格式中直接进行实时分析的简单实用策略仍缺乏充分探索。
除了突变检测之外，突变分数的定量测定（也称为变异等位基因分数，VAF）在分子诊断中的疾病分类、预后评估和治疗监测中变得越来越重要[31], [32]。准确的突变分数分析需要独立量化突变靶标和相应的总靶标丰度。在已建立的方法中，突变分数通常通过测序方法基于测序读计数获得，通过数字计数方法通过独立分子计数获得，或通过基于定量PCR的方法通过分别量化突变型和野生型等位基因获得[33], [34], [35]。因此，直接突变分数分析需要两个独立的定量测量，要么分别确定突变型和野生型等位基因，要么独立量化突变靶标和相应的总靶标丰度。尽管许多近期报道的突变检测方法在突变检测方面表现出优异的分析性能，但相对较少的方案设计能够直接提供突变分数作为分析输出。这些考量促使开发了能够在简单的封闭管反应中独立量化突变靶标和参考靶标的分析策略，以实现直接突变分数分析。
在本工作中，我们开发了一种实时Gap-LCR检测方法，能够实现突变检测和单管突变分数分析。与我们之前与多组分核酸酶（MNAzyme）介导的荧光传导耦合的实时常规LCR平台[36]不同，本检测方法在基于连接的扩增过程中引入了聚合酶介导的间隙填补作为额外的序列依赖性识别步骤。此外，还引入了一种参考位点辅助的双位点策略，以在同一封闭管反应中独立量化突变靶标和相应的参考位点。随后，利用各自的校准曲线从独立量化的突变靶标和参考靶标确定突变分数。这种集成设计将Gap-LCR的分析能力从突变检测扩展到单管突变分数分析，为分子诊断中的简化定量突变分析提供了一种实用策略。
