肝内胆管癌中三级淋巴结构异质性的时空图谱塑造免疫龛及临床结局

《SCIENCE ADVANCES》：Spatiotemporal mapping of tertiary lymphoid structure heterogeneity shapes immune niches and clinical outcomes in intrahepatic cholangiocarcinoma

　　

肝内胆管癌（intrahepatic cholangiocarcinoma，iCCA）是一种高度致命的恶性肿瘤，治疗选择有限。iCCA中三级淋巴结构（tertiary lymphoid structures，TLSs）的空间架构和功能多样性尚不清楚。在此，研究人员展示了一个TLSs的多模态空间图谱，并将瘤内TLSs（intratumoral TLSs，iTLSs）确定为独立的预后标志物。基于214例发现队列和155例验证队列的批量蛋白质组学分析，建立了基于TLS的四层肿瘤微环境（tumor microenvironment，TME）分类系统，并支持开发了TLS预测随机森林分类器。成像质谱流式（imaging mass cytometry，IMC）显示，iTLS+肿瘤具有结构化的免疫架构，其中M1样组织驻留巨噬细胞（resident tissue macrophages，RTMs）、树突状细胞（dendritic cells，DCs）和CXCL13⁺ CD4⁺ T细胞共定位形成与TLS核心区（TLScore-CNs）空间偶联的抗原提呈邻域（antigen-presenting neighborhoods，apc-CNs）。单细胞空间转录组学进一步将61个TLS解析为14个空间生态位，并确定了拟时间成熟连续体：聚集型、活化型和活化后型。由ifnCAFs、iCAFs和CXCL12⁺巨噬细胞主要介导的生态位内通信随成熟进程动态演变。单细胞核RNA测序（single-nucleus RNA sequencing，snRNA-seq）结合基于Tangram的空间映射显示，CXCL12⁺巨噬细胞和iCAFs在聚集型TLS中形成外周带，而ifnCAFs在活化过程中浸润TLS内部。这些发现明确了TLS异质性，并为基质导向的免疫治疗提供了见解。

**研究背景与科学问题**

肝内胆管癌（intrahepatic cholangiocarcinoma，iCCA）是第二常见的原发性肝脏恶性肿瘤，具有侵袭性强的临床行为和显著的分子异质性。尽管PD-(L)1阻断和靶向治疗已取得进展，但临床获益仍局限于特定患者亚群，亟需深入理解肿瘤微环境（tumor microenvironment，TME）特征以指导更精准的治疗分层。三级淋巴结构（tertiary lymphoid structures，TLSs）是TME中的关键免疫组分，多种癌症类型的证据支持其在抗肿瘤免疫和免疫治疗应答预测中的价值。在iCCA中，TLSs在空间分布和成熟状态上均表现出显著异质性：瘤内TLSs（intratumoral TLSs，iTLSs）——尤其含有生发中心的滤泡结构——与患者生存改善和CXCL13⁺ CD4⁺ T细胞募集增强相关；而瘤周TLSs可能通过调节性T细胞富集促进免疫抑制，未成熟聚集（aggregates，Agg）常缺乏预后意义。然而，iCCA中尚缺乏系统性、高分辨率的TLS异质性图谱。为此，研究人员采用整合性空间多模态方法，结合批量与空间蛋白质组学、单细胞核RNA测序（single-nucleus RNA sequencing，snRNA-seq）、成像质谱流式（imaging mass cytometry，IMC）及单细胞空间转录组学，系统解析TLS异质性及其临床意义。

**关键技术方法**

研究人员基于中山大学肿瘤防治中心（Sun Yat-sen University Cancer Center，SYSUCC）的214例发现队列和155例独立验证队列，综合运用以下核心技术：①批量蛋白质组学（液相色谱-串联质谱，LC-MS/MS）鉴定TLS相关蛋白质特征并构建随机森林分类器；②膨胀凝胶空间蛋白质组学用于队列级外部验证；③IMC实现单细胞分辨率的空间免疫架构解析；④10x Genomics Xenium原位空间转录组学对5例样本（433,051个细胞）进行全切片亚细胞分辨率转录组分析；⑤10x Chromium Flex平台snRNA-seq（14例样本，105,226个细胞核）结合Tangram算法将单细胞核转录组高分辨率空间映射至Xenium坐标，实现跨平台整合验证。

**研究结果**

**TLS分布与分类的全景图谱。** 研究人员对214例iCCA肿瘤样本进行空间和形态学评估，通过CD20、CD3、CD21、BCL6和Ki-67染色将TLS分为三种形态：聚集型（Agg）、初级滤泡（FL1）和次级滤泡（FL2）。22.2%的TLS位于瘤内，其余位于瘤周间质，且TLS在距肿瘤边界5 mm范围内呈现强烈的位置偏好。基于瘤内/瘤周TLS状态，建立了四层TLS相关TME分类系统：结构化型（Structured，iTLS⁺）、排除型（Excluded，iTLS^?/pFL⁺）、未成熟型（Immature，iTLS^?/pAgg⁺）和荒漠型（Desertic，iTLS^?/pTLS^?）。该分类具有显著预后价值，多变量分析证实iTLS存在是总生存期（OS；HR=0.52，95%CI：0.33~0.82，P=0.005）和无进展生存期（PFS；HR=0.52，95%CI：0.35~0.77，P=0.001）的独立预后因素。

**蛋白质组学揭示TLS相关免疫亚型。** 批量蛋白质组学分析显示，Structured型肿瘤富集淋巴相关分子（CR2、CD19、MS4A1）及趋化因子CXCL13，而Desertic型肿瘤上调上皮和代谢标志物（如KRT4）。通路富集分析表明Structured型具有增强的免疫激活特征（CD28共刺激、S1PR4信号、IL-12应答），Desertic型则以缺氧、上皮-间质转化和凝血信号为主导。基于蛋白质组特征构建的随机森林分类器在训练集中AUC为84.5%，测试集为90.1%（P<0.001）；在155例独立验证队列中通过膨胀凝胶空间蛋白质组学结合IMC实现外部验证，AUC达92.5%。IMC分析确认了不同TME亚型的空间免疫架构差异：Structured型呈现有序的淋巴聚集结构，Desertic型呈现免疫稀疏、基质/上皮细胞主导的景观。

**TLS富集TME的单细胞空间架构。** IMC分析显示，Structured型TME中T/B细胞形成紧密聚集的成熟TLS结构，周围富集CXCL13⁺记忆CD4⁺ T细胞、CD127⁺和PD1⁺ CD4⁺ T细胞及初始CD4⁺ T细胞。空间邻近分析揭示M1样组织驻留巨噬细胞（RTMs）作为关键结构枢纽，与T/B簇和CXCL13⁺ CD4⁺ T细胞形成紧密关联；树突状细胞（DCs）也定位于TLS附近。M1样RTMs和DCs在TLS区域表现出峰值有效分数，并与CXCL13⁺ CD4⁺ T细胞及T/B簇具有最短相互作用距离。

**空间互作网络定义TLS相关细胞邻域。** 通过有效分数、配对细胞互作和细胞邻域（cellular neighborhood，CN）分析，研究人员鉴定了两个功能不同但空间偶联的邻域：CN8（含T细胞、M1样RTMs和DCs的抗原提呈邻域，apc-CN）和CN19（T/B细胞聚集的TLS核心区邻域，TLScore-CN）。区域富集分析显示CN19特异性定位于TLS区域，CN8则主要分布于TLS周围免疫细胞富集区。iTLS⁺肿瘤中apc-CN与TLScore-CN共现频率显著增高，且CN9（内皮富集）与TLScore-CN和CN8存在显著空间互作，提示血管-免疫串话可能支持TLS相关免疫微环境的形成。

**单细胞空间转录组学揭示TLS分子状态。** 利用10x Xenium平台对433,051个细胞进行空间转录组分析，共鉴定61个TLS结构。以每个TLS为伪批量单位进行主成分分析（PCA），依据分子特征将TLS分为三种拟时间转录状态：聚集型（Aggregated，44%）、活化型（Activated，25%）和活化后型（Postactivated，31%）。聚集型TLS富集CXCL12⁺巨噬细胞、浆细胞和iCAFs；活化型TLS以CXCL13⁺ CD4⁺ T细胞为特征；活化后型TLS则以TCF7⁺ CD4⁺ T细胞和Treg细胞为标志。空间距离分析显示，聚集型和活化型TLS更靠近肿瘤边界，而活化后型TLS距离肿瘤边缘更远，提示TLS成熟可能起始于侵袭前沿并逐步向远端发展。

**时空生态位重塑与细胞间信号。** 研究人员将14个空间解析的细胞生态位映射至TLS拟时间轨迹。聚集型TLS富集含iCAFs和CCL19⁺ CD8⁺ T细胞的生态位及含cDC2和CXCL12⁺巨噬细胞的抗原提呈生态位；活化型TLS显著扩增记忆B细胞、CXCL13⁺ CD4⁺ T细胞、IFN产生型CAFs（ifnCAFs）、mregDCs和GZMK⁺ CD8⁺ T细胞相关生态位；活化后型TLS由TCF7⁺ CD4⁺ T细胞、Treg细胞和生发中心样区域主导。通路富集分析显示聚集型TLS富集血管生成和TGF-β信号，活化型TLS呈现显著IFN应答、IL-10信号和PD-1通路激活，活化后型TLS则富集氧化应激、TNF-α/NF-κB信号和IL-6-JAK-STAT3激活。生态位内通信网络分析揭示主要信号发送细胞类型随成熟进程动态转换：聚集型以CXCL12⁺巨噬细胞和iCAF为信号源，活化型转为IFN产生型CAFs为主，CXCL12信号呈阶段特异性动态模式。

**snRNA-seq与空间映射揭示TLS相关免疫拓扑结构。** 基于10x Chromium Flex平台对14例iCCA样本（8例iTLS⁺，6例iTLS^?）进行snRNA-seq，共获得105,226个细胞核，涵盖T细胞、B细胞、髓系细胞、基质细胞、内皮细胞、上皮细胞等多种组分。富集分析显示iTLS⁺肿瘤富集记忆型和抗原提呈型免疫群体（TCF7⁺ CD8⁺ T细胞、记忆B细胞、CXCL13⁺ CD4⁺ T细胞、cDC1、cDC2和CXCL12⁺巨噬细胞）。功能分析确认CXCL12⁺巨噬细胞具有M1样组织驻留表型，高表达抗原提呈通路和M1相关基因。Tangram空间映射显示：聚集型TLS中iCAFs和CXCL12⁺巨噬细胞富集于TLS外周区域并形成环状分布，CXCL13⁺ CD4⁺ T细胞和记忆B细胞则在活化型TLS中集中于核心区域；iCAFs和ifnCAFs在聚集型中形成环状外周组织，在活化型中逐渐浸润TLS核心。

**关键TLS生态位预测免疫治疗应答。** 研究人员选取五种与TLS分子重塑相关的关键生态位（N3、N4、N5、N10、N13），在三个公开的免疫检查点阻断治疗队列（GSE91061、GSE126044、PRJEB23709）中进行验证。所有数据集中，应答者的生态位特征评分均显著高于无应答者，且高表达与更长总生存期相关。此外，N12和N14在三个数据集中均显示应答者特征评分升高且与更好OS相关，而N8仅在PRJEB23709队列中显著，提示不同TLS相关生态位与免疫治疗应答存在异质性关联。

**总结与讨论**

该研究构建了iCCA中TLS异质性的多维度时空图谱，主要结论包括：①基于TLS空间分布的四层TME分类系统（Structured、Excluded、Immature、Desertic）具有独立预后价值，其中iTLS的存在而非TLS总体数量决定临床结局；②M1样RTMs、DCs和CXCL13⁺ CD4⁺ T细胞形成apc-CN并与TLScore-CN空间偶联，重现淋巴结微解剖结构，提示保守的免疫细胞协作范式；③TLS成熟经历从聚集型到活化型再到活化后型的拟时间连续体，伴随生态位拓扑结构重塑和阶段特异性细胞间通信网络的动态演变；④CXCL12⁺巨噬细胞（M1样RTM表型）作为TLS成核的早期启动者，通过分泌CXCL12、TNF和IL2RA协调免疫细胞募集和空间组织；⑤TLS相关生态位特征可预测免疫检查点阻断治疗应答。研究局限性在于分析主要为观察性和描述性，未来需通过遗传操作模型验证M1样RTMs与TLS形成之间的因果关系，并通过纵向空间分析明确TLS成熟状态是稳定亚型还是动态演化阶段。研究结论为：该空间生态系统分析重新定义了iCCA中TLS生物学景观，证实协调的细胞重组和生态位水平重塑是TLS异质性的基础，对生物标志物开发和治疗靶向具有重要启示，为利用或重工程TLS以克服这一难治性恶性肿瘤的免疫抵抗提供了概念框架。