《Current Issues in Molecular Biology》：Extracellular Vesicles as Molecular Regulators of Viral Infection: Implications for COVID-19 and Future Viral Pandemics
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2019冠状病毒病（COVID-19）由严重急性呼吸综合征冠状病毒2型（SARS-CoV-2）引起，暴露了全球在面对快速演变的病毒大流行时应急准备方面的关键缺口。尽管现有抗病毒治疗在管理COVID-19方面显示出一定疗效，但诸如靶向药物递送效率低下、宿主免疫应
2019冠状病毒病（COVID-19）由严重急性呼吸综合征冠状病毒2型（SARS-CoV-2）引起，暴露了全球在面对快速演变的病毒大流行时应急准备方面的关键缺口。尽管现有抗病毒治疗在管理COVID-19方面显示出一定疗效，但诸如靶向药物递送效率低下、宿主免疫应答异常以及对未来病毒大流行准备不足等重大局限性亦显而易见。这些挑战凸显了对靶向特异、精准且高效的治疗策略以调控病毒入侵及免疫失调的迫切需求。细胞外囊泡（EVs）作为细胞释放的携带货物的纳米级囊泡，其促感染或抑感染作用取决于货物组成。因此，内源性EVs可通过调控关键通路（包括血管紧张素转换酶2（ACE2）介导的病毒入侵、跨膜丝氨酸蛋白酶2（TMPRSS2）依赖性刺突蛋白激活、核因子κB（NF-κB）驱动的炎症信号以及NLRP3炎症小体活化）来促进或抑制COVID-19发病机制。相反，工程化EVs，如表达ACE2的EVs、间充质干细胞来源的EVs以及富含microRNA的EVs，具有治疗潜力，可通过免疫调节、病毒中和及抑制细胞因子风暴来促进抗病毒防御。此外，EV相关的核酸、蛋白质和脂质可作为疾病检测和严重程度分层的生物标志物。深入理解EV-病毒相互作用的机制可增强对类似病毒性疾病的防范能力。本综述对EV-病毒相互作用的分子机制进行了全面分析，强调了EVs在应对COVID-19及未来病毒大流行中的治疗和诊断潜力。
2. COVID-19
COVID-19由SARS-CoV-2引起，是一种具有肺部及全身表现的传染性呼吸道疾病。SARS-CoV-2是一种有包膜的正链RNA病毒，由四种主要结构蛋白组成：刺突（S）、包膜（E）、膜（M）和核衣壳（N）蛋白。S糖蛋白通过受体识别和膜融合介导宿主细胞入侵。感染主要靶向呼吸系统，临床结局从轻度呼吸道疾病到急性肺损伤（ALI），包括其严重形式急性呼吸窘迫综合征（ARDS），后者与重症和死亡相关。SARS-CoV-2持续演变，变异株和亚谱系在传播性、受体结合和免疫逃逸方面表现出变化。尽管疫苗接种和抗病毒治疗大幅减轻了疾病负担，但在重症患者以及病毒演变和宿主免疫应答失调的情况下仍存在挑战。这些特征与EV生物学直接相关，因为EVs可调节病毒-宿主相互作用、炎症信号、免疫应答和生物标志物谱，为后续章节提供了机制背景。EVs作为病毒感染期间细胞间通讯的重要介质，因其反映和影响疾病相关细胞应答的能力，可能与COVID-19尤为相关。在SARS-CoV-2感染中，EVs已被研究作为宿主和病毒相关分子的潜在载体，以及疾病状态和严重程度的潜在指标。EVs在生物体液中的存在及其转运多种分子货物的能力，也使其成为诊断和治疗应用的有吸引力的候选对象。
3. 细胞外囊泡
3.1 生物学功能与货物组成
EVs是由细胞释放的脂质双层包被的细胞外颗粒，参与细胞间通讯。它们天然从细菌、古菌和真核生物三个生命域释放。几乎所有哺乳动物细胞均释放EVs。EVs可包含蛋白质、核酸、脂质、代谢物、化学和结构成分及其他生物活性分子，并将其转运至全身受体细胞。其货物组成反映产生细胞及其生理或病理状态，并可在摄取后改变受体细胞信号。通过生物活性货物的转移，EVs在维持细胞稳态和调节疾病发病机制中发挥关键作用。其膜组成和相关蛋白有助于EV摄取及与受体细胞的相互作用，而其膜包被的货物可在生物体液中检测到，支持其作为治疗载体和液体活检生物标志物的研究。
3.2 生物发生与分类
根据推测的生物发生方式和尺寸，EVs传统上分为三类：外泌体、微囊泡和凋亡小体。外泌体通常被描述为通过内体膜内向出芽产生的小EVs（30–100 nm），而微囊泡是通过质膜外向出泡产生的100–1000 nm囊泡结构。凋亡小体（1–5 μm）在凋亡晚期产生。然而，当前国际细胞外囊泡学会（ISEV）建议强调总称“细胞外囊泡”，并告诫不要使用基于生物发生的术语，除非特定生物发生途径已被证实。当EV群体的生物发生无法确定时，优选基于尺寸、密度、分子组成或细胞来源的操作性描述符。对于质膜来源的囊泡，ISEV2023不鼓励使用“微囊泡”一词，因为该术语历史上被不一致地用于描述大EVs或更广泛的EV群体。在COVID-19研究中解读EVs时，这一更新术语很重要，因为文献中“外泌体”一词被广泛使用，有时缺乏相应生物发生途径的确切证据。
3.3 EVs作为药物递送系统
EVs具有支持其作为药物递送系统（DDS）研究的多种特性，包括脂质双层膜、内源性货物装载机制以及将药物、蛋白质和核酸转移至受体细胞的能力。EVs可被工程化以携带治疗性RNA、蛋白质、肽或小分子，并可被修饰以增强细胞靶向性。然而，与合成递送系统相比，其靶向性或疗效优势的主张仍依赖于具体情境，需要直接比较评估。这些特性为后续治疗策略提供了依据，但其临床转化受限于货物装载效率有限、制造和质量控制挑战、生物分布可变以及潜在的脱靶效应。
4. EV–SARS-CoV-2相互作用的分子机制
4.1 病毒与EVs之间的功能相互作用
病毒和EVs均为亚微米级生物颗粒，由活细胞释放，可转移生物活性分子和遗传物质。病毒与EVs生物发生涉及的细胞机制之间存在相似性，导致某些病毒与EV亚型之间的界限模糊。在不同EV类型中，外泌体几乎完美地类似有包膜病毒的病毒粒子。病毒和EVs可能利用相同受体进行细胞入侵。病毒还可利用EV生物发生和分泌途径促进病毒传播并调节受体细胞应答。此外，病毒感染细胞产生的EVs表现出改变的生理特征，这些改变的EVs不是刺激免疫应答，而是减弱免疫反应。因此，EVs不仅促进病毒传播，还保护病毒免受免疫监视。然而，EVs直接介导感染性病毒传播与转运病毒成分之间的程度取决于病毒和实验情境，且这些机制并非在所有病毒感染中均一致确立。
4.2 ACE2介导的病毒入侵与EV诱饵功能
SARS-CoV-2通过病毒刺突（S）蛋白的受体结合域（RBD）与宿主血管紧张素转换酶2（ACE2）受体结合进入宿主细胞。ACE2在肺部高表达，尤其在II型肺泡（AT2）细胞中。EVs表面表达ACE2，因此可在两个方向调节病毒入侵动力学。当EVs将ACE2递送至受体细胞时，可通过增加宿主细胞上ACE2受体的可用性来提高感染易感性。此外，表达ACE2的EVs与SARS-CoV-2之间的相互作用在某些条件下可能促进病毒蛋白或RNA整合入EVs，从而可能有助于病毒成分的全身传播。另一方面，富含ACE2的EVs可作为竞争性诱饵，与SARS-CoV-2刺突蛋白结合，从而阻止宿主细胞-病毒相互作用。棕榈酰化等翻译后修饰可增强病毒结合亲和力和ACE2的中和潜力。ACE2的棕榈酰化增强其在EV膜上的稳定性及其整合入EVs。诱饵效率也受EV表面展示的ACE2丰度影响。
4.3 蛋白酶激活与内体入侵途径
ACE2结合后，病毒刺突蛋白需要宿主蛋白酶（包括TMPRSS2和内体组织蛋白酶）的蛋白水解激活。EVs可能通过递送蛋白酶和调节局部蛋白水解环境来影响这一过程。此外，EV生物发生与病毒入侵和运输共享常见途径，特别是涉及内体机制，如Ras相关结合鸟苷三磷酸酶（Rab GTPases）、肿瘤易感基因101（TSG101）、ALG-2相互作用蛋白X（ALIX）和运输所需内体分选复合物（ESCRT）。这些共享途径为病毒利用EV生物发生系统增强病毒复制和传播提供了机制基础。
4.4 EV介导的病毒感染调控
EVs在调控病毒感染中发挥关键作用。病毒感染细胞来源的EVs含有病毒蛋白和部分病毒RNA。根据整合的病毒蛋白和遗传物质，EVs既可促进也可阻碍病毒感染。EV介导的转移可促进病毒物质递送或改变受体细胞易感性和免疫应答。在SARS-CoV-2感染中，EV相关病毒成分和囊泡介导的转移已被提出有助于病毒传播。EVs还可携带病毒簇，介导病毒的“囊泡介导的整体传播”，多种病毒基因组可同时穿透并感染同一细胞。病毒感染细胞自发释放EVs，主要是外泌体。这些EVs可将病毒成分转运至邻近细胞，诱导其促进进一步病毒传播。相反，工程化EVs的免疫功能以抑制COVID-19进展具有相当大的潜力。
4.5 EV介导的NF-κB激活与细胞因子风暴
NF-κB依赖性炎症信号通路的过度激活和细胞因子风暴被认为是重症COVID-19的标志。感染细胞来源的EVs携带促炎介质，包括细胞因子（如TNF-α和IL-6）和损伤相关分子模式（DAMPs），如高迁移率族蛋白B1（HMGB1）。这些EV货物可激活Toll样受体（TLR）信号通路，包括TLR4介导的NF-κB激活，从而促进促炎细胞因子产生和细胞因子风暴。
4.6 NLRP3炎症小体激活
EVs在激活NOD、LRR和pyrin结构域蛋白3（NLRP3）炎症小体中发挥重要作用，该炎症小体是COVID-19炎症和焦亡反应的关键介质。线粒体DNA（mtDNA）、病毒RNA和ROS相关信号分子等分子诱导NLRP3炎症小体组装。EVs可将这些分子转移至受体细胞并促进NLRP3炎症小体组装。NLRP3激活可导致caspase-1激活、IL-1β和IL-18成熟以及gasdermin D介导的焦亡，最终促进重症COVID-19肺损伤的加重。
5. EVs对COVID-19的治疗潜力
EVs可帮助维持递送药物的质量并将药物递送至靶区域。EVs的脂质双层包被确保其内部分子（包括抗体和细胞因子）的安全环境，使这些分子能在较长时间内维持强烈的宿主免疫原性应答。EVs可递送药物、蛋白质、纳米颗粒、miRNAs、siRNAs等，同时保持货物质量。EVs的某些成分可促进组织靶向，某些成分可减少非特异性结合。EVs还可被生物工程化以增加其靶向性，甚至可穿越生物屏障，包括血脑屏障。
5.1 ACE2调节型EVs
由于ACE2在COVID-19发病机制中的核心作用，可考虑不同策略利用EVs作为治疗COVID-19的有效工具。潜在策略包括基于EV的DDS、基于EV的疫苗以及调节EV生物发生和摄取途径。体外研究表明，与无囊泡的重组人ACE2相比，表达重组ACE2的EVs在阻止病毒刺突蛋白RBD附着方面效率高135倍，在阻止原始和假型SARS-CoV-2感染方面有效60至80倍。EV-ACE2相互作用水平由其蛋白棕榈酰化决定。ACE2在Cys141和Cys498残基处被锌指DHHC型棕榈酰转移酶3（ZDHHC3）S-棕榈酰化，而被酰基蛋白硫酯酶1（LYPLA1）去棕榈酰化。携带棕榈酰化ACE2的EVs在减少病毒感染方面比常规ACE2携带EVs高效10倍。这些工程化EVs可作为竞争性诱饵受体，隔离SARS-CoV-2颗粒，抑制病毒进入宿主细胞、后续感染以及真实和假型SARS-CoV-2的病毒传播。
5.2 靶向TH17细胞的EVs
EVs具有显著的免疫调节特性，可通过抗原呈递、T细胞激活和炎症信号调节免疫应答。在COVID-19早期阶段，T辅助17（TH17）应答增加导致T辅助1（TH1）应答减少，进而导致促炎细胞因子IL-17上调。IL-17过表达在COVID-19发病机制中至关重要，因为它导致实质损伤并最终导致急性呼吸衰竭。TH17细胞是COVID-19期间高炎症启动的关键介质，靶向TH17细胞可能是有效治疗COVID-19的潜在途径。EVs可转运特定核酸以靶向特定信号级联，从而帮助减少免疫反应。例如，EV相关的调节性核酸，如miRNA467b或miRNA146a，可抑制TH17细胞的增殖和活性，通过下调促炎细胞因子IL-17的表达促进TH1细胞的增殖和活性，从而减轻与重症COVID-19相关的高炎症反应。
5.3 间充质干细胞来源的EVs
间充质干细胞（MSC）来源的EVs在炎症性肺病（包括ALI和ARDS）中显示出治疗潜力，已在临床前研究和I/II期临床试验中得到验证。2020年，一项非随机队列研究评估了ExoFlo（一种同种异体骨髓MSC来源的EV研究性疗法）在重症COVID-19住院患者中的安全性和有效性。单次静脉注射ExoFlo后，患者表现出高炎症反应减轻、免疫稳态恢复和氧合改善，无明显副作用。该研究为多中心、双盲、随机、安慰剂对照的II期临床试验EXIT COVID-19奠定了基础，以评估ExoFlo在COVID-19相关中重度ARDS患者中的疗效。目前，III期临床试验EXTINGUISH ARDS正在评估静脉注射ExoFlo在中重度ARDS住院患者中的安全性和有效性。与上述其他策略不同，MSC来源的EV疗法已进入人体临床研究阶段。
5.4 抗病毒肽偶联EVs
两栖动物肽AR-23最近显示出对有包膜的DNA和RNA病毒（包括SARS-CoV-2）感染早期的有效抗病毒活性。AR-23是一种23个氨基酸的两亲性α-螺旋肽，源自日本蛙（Rana tagoi）的皮肤分泌物，对α冠状病毒（HCoV-229E）和β冠状病毒（SARS-CoV-2）均具有有效抗病毒活性。体外研究表明，AR-23肽在共处理测定中25 μM浓度下实现60%病毒抑制，在预处理测定中12.5 μM浓度下实现50%抑制。AR-23肽还可剂量依赖性地降低病毒刺突（S）和核衣壳（N）蛋白表达，提示抑制病毒进入和复制。机制上，AR-23肽可能通过破坏病毒包膜和从病毒表面脱离S蛋白来促进病毒灭活。鉴于EVs良好的生物相容性和高效的货物递送特性，基于EV的DDS可能代表将抗病毒肽（如AR-23）递送至病毒感染细胞的有效平台。
5.5 血小板来源的EVs
血小板通过促进血栓炎症反应在COVID-19发病机制中发挥关键作用。血小板与中性粒细胞的相互作用导致炎症反应，在重症COVID-19中导致多器官衰竭。研究表明，COVID-19患者产生表型高活性的血小板，与血小板颗粒和细胞外囊泡释放增加相关。在COVID-19患者中，全身炎症促进血小板来源的EVs释放增加，这些EVs可进一步调节凝血、内皮功能障碍和免疫应答。鉴于血小板来源的EVs参与血栓炎症通路，它们可能作为重症COVID-19的治疗靶点。旨在减少血小板激活或抑制血小板来源EVs产生和促血栓信号的治疗策略可能有助于减轻与重症COVID-19相关的血栓炎症和血管并发症。
6. EVs在COVID-19中的诊断潜力
在过去十年中，EVs已在不同液体活检中用作非侵入性诊断和预后生物标志物。目前，EVs正成为各种缺乏可靠预测性诊断生物标志物的肺部疾病的有前景的生物标志物候选物。基于蛋白质组学的SARS-CoV-2感染患者与健康受试者EVs比较鉴定出某些COVID-19的EV相关生物标志物。其中，外壳复合物亚基β2（COPB2）已成为区分轻度和重症COVID-19的有前景候选物。SARS-CoV-2 RNA也已在EV货物中检测到，提示EVs在病毒传播中的潜在作用，同时突显其作为感染指标的价值。此外，COVID-19的标志物在血小板来源的EVs中发现，其丰度随疾病严重程度增加而增加。其他几种EV相关生物标志物可作为COVID-19诊断的有前景工具，包括SARS-CoV-2特异性S1+血清EVs、血清EVs中的核心组蛋白macroH2A.1（MACROH2A1）、富含单唾液酸二己糖神经节苷脂（GM3）的外泌体以及含CD142的EVs。
7. 对未来病毒大流行的启示
改善未来大流行的防范仍是全球优先事项。理想情况下，未来大流行防范应具备基于平台且可适应的治疗方法，能够快速修改以靶向多种病毒机制。专家推测新的大流行最可能由呼吸道病毒引起。历史趋势表明，人畜共患病毒，特别是具有高突变率和广泛宿主范围的RNA病毒，可能在未来几年引起更频繁和更严重的流行病。冠状病毒和流感病毒等病毒家族因其快速传播、进化和免疫逃逸能力而尤其令人担忧。EV生物学可能在此背景下提供这样的平台，因为EVs参与多种病毒感染中的病毒入侵、细胞内运输、免疫调节以及核酸和蛋白质的细胞间转移。受体诱饵EVs、靶向货物递送和免疫调节EVs原则上可适用于使用保守宿主受体或炎症通路的病毒。此外，EV相关分子特征为不同病毒感染中疾病的早期非侵入性检测和实时监测提供了机会。EV平台的关键优势可能是其对病原体特异性要求的模块化适应性。已建立的EV平台可通过修改表面分子或分子货物来重新工程化，以展示病原体结合分子、递送抗病毒核酸、蛋白质、肽或小分子，或携带免疫调节货物。
8. 主要挑战与潜在局限性
尽管作为潜在DDS具有优势，基于EV的治疗平台仍面临实质性挑战。最终产品的变异性是EV治疗平台的主要障碍。EV的分离和纯化过程尚未标准化，某些EV的表征过程也未完全确立，可能导致最终产量的显著差异。另一个瓶颈是EVs装载外源性药物的空间非常有限。纳米级囊泡含有来自其来源细胞的各种内容物，因此EVs中可用于装载外源性药物的空间不足。此外，考虑到满足制药和生物医学公司的全球需求的高要求，EV的临床级生产不足。建立一致的制造和质量控制仍是EV治疗临床转化的主要挑战。EV生产细胞的来源和培养条件、分离纯化方法以及储存条件的变化可影响EV产量、组成、纯度、效力和稳定性，使批次间一致性难以实现。此外，EV治疗的监管框架仍然复杂且因司法管辖区而异。大规模生产需要可扩展的封闭制造工艺、明确的原材料、验证的纯化程序、适当的放行标准以及符合良好生产规范（GMP）的稳健质量控制体系。
9. 结论
细胞外囊泡（EVs）已成为病毒发病机制的关键调节因子，并代表COVID-19治疗和诊断应用的有前景平台。通过调节病毒入侵、免疫应答和炎症信号的能力，EVs为靶向干预提供了独特机会。工程化EVs，包括病毒诱饵、药物递送载体和免疫调节剂，进一步扩展了其转化潜力。此外，EV相关分子特征为非侵入性诊断和疾病监测提供了有价值的工具。对EV-病毒相互作用的见解也可能有助于制定应对未来病毒大流行的策略。然而，诸如装载足够货物困难、可扩展性有限以及提高靶向效率的需求等挑战必须加以解决以促进临床转化。总体而言，EV生物学和单囊泡技术的持续进展有望推动下一代精准治疗和病毒性疾病诊断的发展。然而，关于EV产品的可重复性和效力、其体内生物分布、最佳给药策略及其长期安全性和免疫原性仍存在若干关键问题。解决这些不确定性，以及建立标准化的制造、表征和监管标准，对于EV治疗和诊断实现广泛临床应用至关重要。
