内分泌干扰物诱导的性别特异性毒性的靶点与机制鉴定：网络毒理学与青鳉鱼实验证据的整合

《Aquatic Toxicology》：Identifying Targets and Mechanisms of Endocrine Disruptor-Induced Sex-Specific Toxicity: Integration of Network Toxicology and Medaka Experimental Evidence

　　

摘要

环境内分泌干扰物（EDCs），包括邻苯二甲酸二(2-乙基己基)酯（DEHP）和丙基对羟基苯甲酸酯（PrP），是广泛存在的环境污染物，对生殖健康具有不利影响。然而，其性别特异性毒性的机制，尤其在联合暴露条件下，仍未完全阐明。本研究将实验毒理学与基于网络的分析相结合，探讨DEHP和PrP对日本青鳉（Oryzias latipes）的生殖毒性，重点关注脑-性腺-肝脏轴。经28天暴露后，DEHP暴露使性腺体指数（GSI）降低60.45%，并使雌性性腺17β-雌二醇（E2）和睾酮（T）水平分别升高至203.57 pg/g和2.39倍（p < 0.05）。在雄性中，DEHP暴露使性腺E2和T浓度分别升高至87.52 pg/g和38.73 pg/g，而联合暴露使肝脏卵黄蛋白原（VTG）水平升高1.37倍。相比之下，DEHP暴露的雌性肝脏VTG浓度降低了735.45 ng/g（p < 0.05）。网络毒理学分析鉴定出PTGS2、BCL2、EGFR、ESR1和IL10为DEHP的主要相关靶点，而PrP则预测通过EGFR酪氨酸激酶抑制剂耐药途径影响AKT1和STAT3。脑、性腺和肝脏中激素水平和基因表达的变表明下丘脑-垂体-性腺轴的全身性失调。尽管DEHP和PrP具有不同的分子靶点，但两者汇聚于共同的通路，包括化学致癌-受体激活和PI3K/Akt信号通路。这些发现证明了DEHP和PrP对脑-性腺-肝脏轴的性别特异性破坏，并强调了在生殖危害评估中考虑联合EDCs暴露的重要性。

引言

对羟基苯甲酸酯类（PBs）和邻苯二甲酸酯类（PAEs）在近一个世纪以来被广泛用于个人护理产品（PCPs）、食品包装、药品和建筑材料中（Rivera-Nú?ez等人，2022年；Soriano等人，2020年）。DEHP是应用最广泛的PAEs之一，在全球各地水环境中频繁被检出。据报道，全球地表水中DEHP的浓度范围为0.33至97.87 μg/L（Magdouli等人，2013年），而欧洲多个国家地表水中报告的浓度为0.05-0.65 ppb（Yuwatini等人，2006年）。在中国，不同地点地表水中DEHP的浓度范围报告为5至76 μg/L（Wang等人，2008年）。在美国，DEHP已在42个州的公共供水系统中被检出，这些系统共服务超过4500万人口，浓度范围为0.05至250 μg/L（ATSDR，2022年）。大多数PAEs在水环境中化学性质持久，DEHP的水解半衰期可超过100年（Gao等人，2018年）。由于其广泛存在、持久性和潜在毒性，DEHP已被列入美国和中国的水保护优先污染物清单（Planello等人，2011年）。PrP是个人护理产品、药品和食品中常用的抗菌防腐剂（B??dzka等人，2014年；Vale等人，2022年）。由于PrP的广泛使用和国内及工业废水的持续排放，它在水环境中也频繁被检出，且其在环境中与DEHP的共存已被记录（Saha等人，2022年）。PBs通常以ng/L至低μg/L的浓度存在于地表水中，而在废水进水中报告的浓度则高得多（Haman等人，2015年）。虽然传统废水处理可以去除相当比例的PBs，但极少能完全消除，残留化合物仍可能在处理后的排放水和受纳水体中检出（Min等人，2024年）。尽管PrP通常表现出比一些经典EDCs更弱的内分泌活性（Brand等人，2018年），但实验证据表明它可以干扰水生生物的内分泌和生殖过程。例如，日本青鳉胚胎暴露于40至4000 μg/L的PrP会产生发育和病理学效应，在4000 μg/L下观察到孵化后存活率受损和组织形态改变（Gonzalez-Doncel等人，2014年）。这些发现表明，尽管PrP的内分泌活性相对较弱，它仍可能产生生物学上有意义的生殖效应。这些效应值得进一步调查，特别是在涉及其他EDCs的联合暴露条件下。

目前的研究已从评估单一物质的风险转向识别PAEs和PBs同时暴露时产生的毒理学机制（Chen等人，2023年）。PAEs和PBs均属于EDCs类别。它们的巨大产量和可能对人体内分泌系统功能的干扰使研究人员担忧其对人类生殖系统产生负面影响（Hwang等人，2024年；Kahn等人，2020年；Rauert等人，2024年）。尿液和卵泡液中DEHP的浓度会影响女性月经周期的时长和经期（Li等人，2024a）。体内DEHP及其代谢产物的暴露也与男性生殖功能障碍密切相关，包括睾酮（T）水平改变和精子质量受损（Wang等人，2019年）。在鱼类中，生殖内分泌控制基于脑、性腺和肝脏之间的相互作用。脑通过下丘脑-垂体-性腺（HPG）轴调节生殖过程。在此轴中，下丘脑神经内分泌因子调节垂体促性腺激素，后者调节配子形成和类固醇激素（Vissio等人，2021年）。性腺作为关键生殖器官产生性类固醇，而肝脏通过类固醇代谢和卵黄蛋白原（VTG）合成参与生殖调节（Rajakumar和Senthilkumaran，2020年；Tokarz等人，2015年）。因此，对这些相互关联器官中任何信号传导或内分泌功能的干扰都会影响激素稳态和生殖。EDCs能够破坏HPG轴活性和激素合成、代谢和功能（Hlisnikova等人，2020年；Silva等人，2023年）。女性的月经周期特征反映了HPG轴的活性、排卵和女性的生殖功能（Itriyeva，2022年）。

网络毒理学是新兴的跨学科领域之一，利用生物信息学、大数据、基因组学等技术研究生物系统并揭示负责毒理学活动的多重调控通路。由于结合能与配体-受体复合物的稳定性和相互作用能力直接相关，分子对接被用于确定小分子（配体）在生物大分子（受体或酶）活性位点中的空间排列和结合。最近的研究已使用网络毒理学和分子对接来调查三甘油酸酯酯（乙酰三丁基柠檬酸酯，一种广泛使用的增塑剂添加剂）的潜在毒性和作用机制（Huang，2023年）以及阿斯巴甜的致癌潜力（Chen和Hou，2024年）。

小型观赏鱼类，如日本青鳉，作为生态毒性测试中评估EDCs安全性的替代模型，受到了广泛关注（Shima和Mitani，2004年；Wang等人，2020年；Wittbrodt等人，2002年）。日本青鳉具有多项实验优势，包括短生殖周期、异步产卵、易于繁殖、维护成本低、对有毒物质高度敏感以及已完全测序的基因组（Ishikawa，2000年；Iwamatsu，2004年；Kasahara等人，2007年）。它们在基因和组织水平上与人类具有高度同源性（Kodera和Matsui，2022年）。日本青鳉雌性暴露于DEHP后，VTG浓度和GSI显著下降，卵巢中成熟卵数量减少，而雄性群体未出现负面结果。即使在发育关键期短暂暴露于超低剂量DEHP，也足以对生殖系统造成不可逆的损害。胚胎期暴露于DEHP（0.001、0.1和10 ppb）21天的雌性鱼类，成年后产卵数、受精率和孵化率均降低。成年雄性成熟精子数量减少且精子异常增加，而成年雌性卵巢中成熟卵母细胞（卵黄细胞）数量降低（Yuen等人，2020年）。尽管PBs的雌激素性质不强，但表现出中度的雌激素和抗雄激素活性（Liang等人，2023年）。尽管DEHP和PrP均引起毒性，但尽管这两种化合物在环境中普遍共存，关于它们联合效应的研究却很少。尽管单一EDCs的效果通常不显著，但多种EDCs的联合效应可能有害（Pironti等人，2021年）。

因此，本研究旨在同时采用实验和计算方法来评估DEHP和PrP对日本青鳉脑-性腺-肝脏轴的影响。本研究还评估了DEHP和PrP暴露沿该轴所影响的激素反馈和基因表达。通过网络毒理学和分子对接，发现了两者之间的核心靶点和共同通路，从而增加了对跨组织发生的潜在调控机制的理解。这些信息可以为了解环境EDCs对水生动物的影响提供知识。

化学试剂

丙基对羟基苯甲酸酯（PrP）（CAS号94-13-3；纯度>99.5%）和邻苯二甲酸二(2-乙基己基)酯（DEHP）（CAS号117-81-7；纯度>99.0%）购自上海源叶生物科技有限公司（中国上海）。二甲基亚砜（DMSO；CAS号67-68-5；纯度>99.8%）购自上海阿拉丁生化科技有限公司（中国上海）。

日本青鳉饲养

本研究使用的日本青鳉已在实验室饲养系统中繁殖多代。每个20 L饲养缸……

发育毒性和性腺组织病理学

在雄性青鳉中，暴露于PrP（2849.4 μg/L）后的体重显著低于对照组（p < 0.05）。与对照组相比，DEHP（131.7 μg/L）、PrP（2849.4 μg/L）和联合暴露组的GSI分别升高1.32倍、1.05倍和0.96倍；然而，这些差异均未达到统计学显著性。在雌性青鳉中，DEHP单独暴露组和联合暴露组的GSI分别显著降低60.45%和59.75%。

结论

本研究将实验毒理学与网络毒理学相结合，探讨DEHP和PrP诱导的生殖毒性在日本青鳉中的性别特异性机制。实验证据表明，DEHP和PrP均损害卵巢和精子发育，并显著改变VTG和性激素水平（包括E2和T），在所测试的暴露条件下，DEHP诱导的激素改变幅度大于PrP，这一差异……

缩写

EDCs：环境内分泌干扰物；PCPs：个人护理产品；PAEs：邻苯二甲酸酯类；PBs：对羟基苯甲酸酯类；DEHP：邻苯二甲酸二(2-乙基己基)酯；PrP：丙基对羟基苯甲酸酯；VTG：卵黄蛋白原；HPG：下丘脑-垂体-性腺；GSI：性腺体指数；E2：17β-雌二醇；T：睾酮；FSH：促卵泡激素；LH：促黄体激素；GnRH：促性腺激素释放激素。

CRediT作者贡献声明

李云阳：撰写-初稿，方法论，数据整理，概念构思。郑娜：撰写-审阅与编辑，监督，方法论，资金获取。潘嘉敏：可视化，软件。王苏静：验证，形式分析。

CRediT作者贡献声明

李云阳：撰写-初稿，方法论，数据整理，概念构思。郑娜：撰写-审阅与编辑，监督，方法论，资金获取。潘嘉敏：可视化，软件。王苏静：验证，形式分析。

李云阳 | 郑娜 | 潘嘉敏 | 王苏静

教育部吉林大学地下水资源与环境重点实验室，中国