1型糖尿病儿童高酮血症与循环硫化氢降低的关联及酮体对培养肝细胞胱硫醚-γ-裂解酶mRNA表达的抑制

《Genes》：The Association Between Hyperketonemia and Reduced Circulating Hydrogen Sulfide in Children with Type 1 Diabetes, and Ketone Inhibition of Cystathionine-γ-Lyase mRNA Expression in Cultured Hepatocytes

　　

背景：硫化氢（H₂S）以其显著的抗炎、抗氧化和血管保护特性而闻名。在糖尿病患者中，观察发现血液H₂S水平较低。1型糖尿病（T1D）患者常同时存在高酮血症和高血糖症。胱硫醚-γ-裂解酶（CSE）是由CTH基因编码的酶，负责H₂S的生物合成。然而，酮体对CTH基因的下调是否与H₂S水平降低相关仍不确定。目的：本研究旨在检验以下假设：酮体降低培养肝细胞中的CTH基因表达，且高酮血症与T1D中H₂S水平呈负相关。方法：在获得书面知情同意后，研究人员采集了T1D儿童（n=36）和年龄匹配的健康对照者（n=35）的空腹血样。分析了血浆中H₂S、25(OH)VD、酮体和炎症生物标志物的水平。为了评估高血糖和高酮血症对CTH基因表达的影响，研究人员将培养的肝细胞暴露于高葡萄糖、乙酰乙酸或β-羟基丁酸中。结果：与健康对照者相比，T1D患者的血液H₂S和25(OH)VD水平显著降低。血浆H₂S浓度与总酮体、β-羟基丁酸（BHB）、乙酰乙酸和基质金属蛋白酶-9（MMP-9）呈负相关，而与HDL-胆固醇和25(OH)VD呈正相关。在培养的肝细胞中，暴露于乙酰乙酸和高葡萄糖与CTH mRNA表达降低相关。结论：在T1D儿童和青少年中，较低的循环H₂S浓度与高酮血症及炎症/代谢异常相关。体外研究结果提示，高葡萄糖和乙酰乙酸可能影响CTH转录；然而，仍需进一步测量CSE蛋白、酶活性和H₂S产生的研究来阐明潜在机制并确立因果关系。

**论文解读：1型糖尿病儿童高酮血症与硫化氢水平降低的关联及其分子机制探索**

**研究背景与目的**
1型糖尿病（T1D）是一种以胰腺β细胞破坏为特征的自身免疫性疾病，导致绝对胰岛素缺乏和持续性高血糖。与2型糖尿病（T2D）不同，T1D常伴随高酮血症，其根源在于胰岛素缺乏导致肝脏酮体生成增加。在未控制的T1D病例中，循环酮体浓度可达约25 mM。尽管酮体在葡萄糖缺乏时是重要的替代能源，但过度积聚可引发氧化应激、炎症和血管功能障碍等多种不良生物学效应。因此，明确酮体代谢与血管并发症之间的分子关联、寻找新的干预靶点，对T1D患者的长期心血管健康具有重要的临床意义。硫化氢（H₂S）是一种内源性气体递质，因其抗炎、抗氧化和血管保护特性，在维持心血管稳态中发挥关键作用。既往研究发现，T2D患者和链脲佐菌素诱导的糖尿病大鼠血液H₂S水平显著下降，T1D小鼠模型中H₂S生物利用度降低与血管反应性受损相关。胱硫醚-γ-裂解酶（CSE）是由CTH基因编码的关键酶，负责心血管系统中的H₂S产生，其表达缺陷可导致内源性H₂S减少并促进早期动脉粥样硬化病变形成。然而，酮体是否通过下调CTH基因表达而降低H₂S水平，以及儿童T1D患者中循环酮体、H₂S与炎症标志物之间的关系，此前尚未得到充分研究。本研究旨在验证两个假设：酮体可降低培养肝细胞中的CTH基因表达；T1D患者的高酮血症与循环H₂S水平呈负相关。该研究发表在《Genes》期刊。

**研究方法与关键技术**
研究人员开展了一项病例对照研究，纳入36名T1D儿童和青少年患者及35名年龄匹配的健康对照者，年龄范围8至21岁。受试者均签署书面知情同意书，T1D诊断依据临床标准（高血糖、酮症、低或无C肽、胰岛素依赖及胰岛自身抗体阳性）。研究使用了多项关键技术：采用亚甲基蓝法测定血浆H₂S浓度，基于锌乙酸盐捕获硫化物并结合酸性条件下的显色反应；使用商品化酶联免疫吸附试验（ELISA）试剂盒检测25-羟基维生素D [25(OH)VD]和基质金属蛋白酶-9（MMP-9）水平；酮体（乙酰乙酸和β-羟基丁酸）测定依据已发表方法进行，并计算总酮体浓度。在细胞实验部分，研究人员使用人肝细胞系HepG2（ATCC），分别以高葡萄糖（25 mM）、乙酰乙酸（2、4、6 mM）和β-羟基丁酸（3、6、12 mM）处理24小时，并以甘露醇作为高葡萄糖处理的渗透压对照；采用Alamar Blue法评估细胞活力；通过定量实时PCR（qRT-PCR）检测CTH mRNA相对表达量，以GAPDH为内参基因，使用2^-ΔΔCt法进行计算。统计分析采用SigmaStat软件，连续变量以均值±标准误表示，组间比较使用t检验、Mann-Whitney U检验或方差分析（ANOVA）等适当方法，并通过多元线性回归分析调整潜在混杂因素。

**研究结果**
**3.1 人体研究：T1D患者循环H₂S和25(OH)VD降低，并与酮体和代谢指标相关**
与健康对照组相比，T1D患者的空腹血糖、HbA1c、乙酰乙酸、β-羟基丁酸（BHB）及总酮体浓度均显著升高，而循环H₂S和25(OH)VD浓度显著降低。在T1D队列中，血浆H₂S浓度与总酮体（r=-0.43，p=0.04）、BHB（r=-0.41，p=0.05）和乙酰乙酸（r=-0.55，p=0.01）呈显著负相关；H₂S与25(OH)VD（r=0.46，p=0.05）和HDL-胆固醇（r=0.57，p=0.01）呈正相关，而与MMP-9（r=-0.49，p=0.03）呈负相关。此外，25(OH)VD与HbA1c（r=-0.49，p=0.01）、空腹血糖（r=-0.44，p=0.03）和MMP-9（r=-0.44，p=0.05）呈负相关。在按总酮体浓度划分的正常酮血症与高酮血症亚组中，两组在C反应蛋白（CRP）、HDL-胆固醇和H₂S方面存在显著差异，而MMP-9、TNF-α和甘油三酯差异不显著。
**3.2 细胞实验：高葡萄糖和乙酰乙酸降低HepG2细胞CTH mRNA表达**
在培养的HepG2肝细胞中，暴露于高葡萄糖（25 mM）24小时显著降低了CTH mRNA表达（p<0.05）；乙酰乙酸处理也观察到CTH mRNA表达的降低。相比之下，β-羟基丁酸处理未显示出明确的CTH表达抑制作用。所有处理条件均未显著影响细胞活力。这些结果表明，高葡萄糖和乙酰乙酸可能直接下调肝脏CTH基因转录，从而为高酮血症与H₂S降低之间的联系提供了一个潜在的分子机制。

**讨论与结论**
本研究的核心发现是，T1D儿童和青少年循环H₂S/硫化物水平显著低于健康对照者，且较低H₂S水平与较高酮体浓度、较低HDL-胆固醇和25(OH)VD水平以及较高MMP-9水平相关。细胞实验进一步显示高葡萄糖和乙酰乙酸与CTH mRNA表达降低相关，提示高酮血症可能通过抑制CTH转录而损害内源性H₂S生物合成。这一结果与既往研究一致，即高血糖可降低内皮细胞中CTH表达和内源性H₂S产生，而H₂S供体可改善高糖条件下的内皮功能。H₂S与25(OH)VD的正相关性以及在T1D患者中两者的同时降低，提示维生素D状态可能通过CSE/H₂S通路影响血管炎症，1,25-二羟基维生素D₃在高糖条件下可增强CSE激活和H₂S产生的研究支持了这一生物合理性。H₂S与MMP-9的负相关及与HDL-胆固醇的正相关也表明，H₂S减少可能与T1D中的促炎性和血管风险表型相关。然而，研究人员明确指出，临床部分为观察性研究，不能确立因果关系；细胞实验仅检测了CTH mRNA水平，未直接测定CSE蛋白丰度、酶活性或细胞H₂S产量；样本量尤其是高酮血症亚组较小；亚甲基蓝法所测定的硫化物池为操作条件下的测得值，不等同于游离生物活性H₂S；且研究未评估临床血管结局。结论指出，T1D儿童和青少年表现出较低的循环H₂S/硫化物和25(OH)VD水平，血浆H₂S/硫化物较低与酮体升高、HDL胆固醇和25(OH)VD下降及MMP-9升高相关，培养肝细胞中高葡萄糖和乙酰乙酸导致CTH mRNA表达下降。这些发现提示酮体代谢改变可能与T1D患者的CSE/H₂S通路变化有关，但需要进一步研究来阐明分子机制并探索CSE/H₂S通路调节在T1D中的治疗潜力。