《SCIENCE ADVANCES》：TCR-JANUS engager proteins enable bispecific targeting to overcome tumor heterogeneity in TCR-T cell therapy
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T细胞受体（TCR）为基础的免疫治疗受限于肿瘤抗原异质性，这常导致复发。研究人员开发了一种双特异性TCR-JANUS衔接器，其可与TCR工程化T细胞（TCR-T）协同发挥作用。与靶向CD3的传统T细胞衔接器不同，TCR-JANUS同时结合转基因TCR的可变区（
T细胞受体（TCR）为基础的免疫治疗受限于肿瘤抗原异质性，这常导致复发。研究人员开发了一种双特异性TCR-JANUS衔接器，其可与TCR工程化T细胞（TCR-T）协同发挥作用。与靶向CD3的传统T细胞衔接器不同，TCR-JANUS同时结合转基因TCR的可变区（TRBV）和肿瘤表面抗原。利用靶向人源化KRAS-G12V特异性TCR和滋养层细胞表面抗原2（Trop2）的模型系统，研究人员证明TCR-JANUS能有效引导TCR-T细胞裂解表达Trop2的肿瘤细胞，同时保留其对同源pHLA靶点的内在特异性，从而实现双抗原同时识别。在异质性肿瘤模型中，TCR-JANUS与TCR-T细胞联合应用（该整合系统称为T细胞双重武器库重构，T-DART）通过清除抗原性不同的肿瘤细胞群体，强效抑制了肿瘤生长。此外，与基于抗CD3的衔接器相比，TCR-JANUS在慢性刺激下维持了增强的T细胞功能并减少了耗竭。综上，该方法提供了一种靶向且持久的策略来克服抗原异质性，拓展了TCR-T细胞治疗在实体瘤中的临床应用前景。
**论文解读：TCR-JANUS衔接器蛋白克服TCR-T细胞治疗中的肿瘤异质性**
**研究背景与问题**
T细胞受体（TCR）靶向免疫治疗在实体瘤中已展现出临床潜力，随着KIMMTRAK（靶向gp100治疗葡萄膜黑色素瘤）和Afami-cel（靶向MAGE-A4治疗滑膜肉瘤）获批，TCR工程化T细胞（TCR-T）疗法成为肿瘤过继细胞治疗的重要方向。然而，TCR-T治疗面临持久完全缓解的障碍，其中肿瘤抗原异质性是最主要的驱动因素之一，可导致适应性耐药和治疗后复发。肿瘤抗原包括细胞内和细胞外靶点；传统嵌合抗原受体T细胞（CAR-T）仅能靶向表面抗原，而TCR-T可识别主要组织相容性复合体（MHC）分子提呈的细胞内和细胞外抗原。癌驱动突变产生的共享新抗原（如非小细胞肺癌、结直肠癌和胰腺癌中反复出现的KRAS突变）是TCR-T疗法的理想靶点；同时，滋养层细胞表面抗原2（Trop2）、叶酸受体α（FRα）等表面抗原在多种肿瘤中高表达。由于过继转移的TCR-T细胞可在体内长期存续，利用这种持久性同时靶向细胞内新抗原（经TCR）和细胞外抗原（经衔接器分子）成为克服肿瘤异质性的策略。传统双靶向策略如双靶CAR-T或基于CD3的T细胞衔接器（TCE）存在非特异性T细胞激活、全身炎症毒性和T细胞耗竭等问题。因此，研究人员提出靶向TCR可变区（TRBV）的“TCR衔接器”设计，以特异性招募TCR-T细胞，但该策略是否能在保留内在pHLA介导反应的同时有效激活T细胞尚不清楚。
**研究内容与主要结论**
研究人员设计了一种双特异性TCR衔接器蛋白，命名为TCR-JANUS，同时靶向人源化KRAS-G12V特异性TCR的TRBV6可变区和肿瘤表面抗原Trop2（α-Trop2-V6）。体外实验表明，α-Trop2-V6能有效结合h1-2C TCR和Trop2蛋白，介导T细胞与靶细胞间的黏附，诱导TCR-T细胞对Trop2阳性肿瘤细胞的细胞因子分泌和杀伤，同时保留其对KRAS-G12V新抗原的内在反应性。体内异种移植瘤模型中，α-Trop2-V6联合h1-2C TCR-T细胞显著抑制Trop2阳性DLD1肿瘤生长。与靶向CD3的TCE相比，α-Trop2-V6在持续刺激下减少T细胞耗竭，维持TCR表达和中央记忆T细胞（TCM）比例，保留细胞毒性。在异质性肿瘤模型（SW620-A11/DLD1混合瘤）中，单用TCR-T细胞无法抑制肿瘤，而联合α-Trop2-V6后显著抑制肿瘤生长并清除抗原性不同的肿瘤细胞群体。此外，靶向FRα的TCR-JANUS（α-FRα-V6）同样能引导TCR-T细胞杀伤FRα阳性肿瘤细胞并消除混合肿瘤中的异质性群体，且α-Trop2-V6与另一TRBV6 TCR（1G4 TCR）联用可增强对共表达NY-ESO-1和Trop2肿瘤细胞的杀伤，证明该平台的通用性。该整合策略被命名为T-DART（T细胞双重武器库重构），论文发表在《SCIENCE ADVANCES》。
**关键技术与方法**
研究采用的主要技术方法包括：表面等离子体共振（SPR）检测蛋白质间结合动力学；纳米差示扫描荧光法（NanoDSF）评估蛋白热稳定性；z-Movi细胞亲合力分析测量T细胞与靶细胞间黏附强度；流式细胞术检测细胞表面标志物、细胞内细胞因子和T细胞分化/耗竭表型；ELISA和ELISPOT定量细胞因子分泌；基于荧光素酶的生物发光细胞毒性实验评估杀伤效率；异种移植瘤模型（NCG小鼠）评价体内抗肿瘤疗效。样本来源方面，T细胞来自健康供体外周血单个核细胞（PBMCs），伦理审批编号为APIMCAS2022075；肿瘤细胞系购自ATCC或中国医学科学院细胞资源中心。
**研究结果分述**
*抗Trop2 TCR-JANUS衔接器蛋白联合TCR-T细胞介导抗肿瘤免疫*：SPR证实α-Trop2-V6结合h1-2C TCR（KD=318 nM）和Trop2（KD=4.14 nM）；z-Movi显示其增强T细胞与DLD1黏附；α-Trop2-V6诱导CD4+和CD8+ TCR-T细胞针对Trop2阳性细胞产生IFN-γ和TNF-α，并以剂量依赖方式增强对DLD1的杀伤，且不影响对KRAS-G12V阳性SW620-A11细胞的反应。体内实验中，α-Trop2-V6联合TCR-T显著抑制DLD1肿瘤。
*抗Trop2 TCR-JANUS蛋白诱导持续抗肿瘤功效*：与α-Trop2-CD3相比，α-Trop2-V6处理的TCR-T细胞增殖增强，CD3和转基因TCR表达得以保留，TCM细胞比例增加；持续培养后，α-Trop2-V6维持了对DLD1和SW620-A11的细胞毒性，而α-Trop2-CD3处理显著降低了细胞毒性；重复共培养后，α-Trop2-V6诱导的PD-1和LAG-3表达显著低于α-Trop2-CD3。在1G4 TCR-T模型中，两种衔接器杀伤效果相当，但α-Trop2-V6诱导的细胞因子水平更低，提示较低的细胞因子释放综合征（CRS）风险。
*α-Trop2-V6与TCR-T细胞的协同活性对异质性肿瘤产生强效抗肿瘤反应*：针对不同Trop2表达水平的HT29克隆，α-Trop2-V6介导的细胞因子产生和杀伤效率随抗原密度升高而增强。在SW620-A11（KRAS-G12V阳性）与DLD1（Trop2阳性）混合培养中，TCR-T细胞联合α-Trop2-V6可同时清除两种肿瘤细胞；对三重混合（SW620-A11+DLD1+HT29-Trop2Low）同样有效。体内SW620-A11/DLD1混合瘤模型中，单用TCR-T细胞不能抑制肿瘤生长，而联合α-Trop2-V6后显著抑制肿瘤体积和重量。
*TCR-JANUS衔接器通过增强TRBV6靶向T细胞毒性克服肿瘤异质性*：α-FRα-V6特异性结合FRα过表达细胞，以剂量依赖方式诱导TCR-T细胞对A375、HeLa和SKOV3的IFN-γ产生和杀伤；在FRα阳性细胞与SW620-A11混合模型中，α-FRα-V6实现双群体清除。α-Trop2-V6与1G4 TCR-T细胞联用时，即使在低效靶比（1:4）下也显著增强对共表达NY-ESO-1和Trop2的HCC-827和MCF-7细胞的杀伤，而对Trop2阴性的A375细胞无增强效应。
**讨论与结论**
研究讨论指出，TCR-JANUS衔接器通过靶向TRBV域，实现对外输TCR-T细胞的特异性招募，具有三个优势：特异性T细胞招募（避免CD3靶向的泛T细胞激活）、持续的T细胞反应性（减少耗竭）和增强的肿瘤浸润（亲和力差异促进肿瘤富集）。在NCG免疫缺陷小鼠模型中尚难以完全评估体内T细胞耗竭表型，需进一步研究。研究结论认为，设计的同时靶向特定TCR的TRBV域和肿瘤表面TAA的双特异性TCR-JANUS蛋白，与TCR-T细胞联合组成T-DART系统，能特异性招募TCR-T细胞攻击额外表面抗原，同时保留其内在pHLA靶向能力，从而克服肿瘤异质性，拓展TCR-T细胞在实体瘤中的临床应用。
