天祝白牦牛出生后睾丸成熟过程中的转录组动态与细胞外基质重塑

《Animals》：Transcriptomic Dynamics and ECM Remodeling During Postnatal Testicular Maturation in the Tianzhu White Yak

　　

摘要：牦牛（Bos grunniens）睾丸发育的分子机制仍知之甚少。本研究对天祝白牦牛三个出生后发育阶段（0.5岁（青春期前）、2.5岁（青春期）和4.5岁（成年））的睾丸组织进行了RNA测序（RNA-seq），每组6只动物。研究人员将差异表达分析与加权基因共表达网络分析（WGCNA）相结合，以表征与睾丸成熟相关的转录组变化。在0.5岁与2.5岁组之间共鉴定出9646个差异表达基因（DEGs），而2.5岁与4.5岁组之间仅检测到126个DEGs，表明向青春期的过渡是睾丸发育过程中转录重编程最活跃的阶段。功能富集分析显示，黏着斑（focal adhesion）和细胞外基质–受体相互作用（extracellular matrix–receptor interaction）是最显著富集的京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路，提示细胞外基质（ECM）重塑可能在血睾屏障（BTB）建立和睾丸成熟中发挥潜在作用。WGCNA鉴定出7个与年龄相关的共表达模块。turquoise模块与发育阶段呈最强正相关，并显著富集参与精子细胞分化和成熟的基因，包括SPATA6、SPMIP11、TNP1和ODF1。综上，这些发现为牦牛睾丸发育提供了全面的转录组学特征描述。

论文解读：天祝白牦牛出生后睾丸成熟过程中的转录组动态与细胞外基质重塑

一、研究背景与科学问题

牦牛（Bos grunniens）是青藏高原最重要的家畜物种，为当地牧民提供肉、奶、纤维和役用动力。天祝白牦牛是分布于甘肃省天祝藏族自治县的特有白色被毛品种，适应2400–4000米的高海拔恶劣环境，截至2025年种群数量约15.28万头，具有重要的文化和经济价值。然而，与其它家养牛科动物相比，牦牛繁殖效率长期偏低，表现为性成熟晚、繁殖季节性强烈、受胎率低。因此，阐明调控睾丸发育和精子发生的分子机制，对于繁殖生物学和遗传改良均具有重要意义。

哺乳动物出生后睾丸成熟经历多个阶段：青春期前以支持细胞增殖和精原干细胞自我更新为特征；青春期以减数分裂启动、血睾屏障（blood–testis barrier，BTB）形成和单倍体精子细胞出现为标志；成年期则以持续精子发生为特征。尽管牛、羊、猪、鸡和山羊等物种的睾丸发育转录组研究已有报道，但牦牛睾丸发育的分子特征研究仍然有限。已有研究利用全转录组测序表征了牦牛睾丸发育过程中的mRNA、lncRNA、circRNA和miRNA，但针对单一牦牛品种跨多个发育阶段整合批量RNA-seq与加权基因共表达网络分析（WGCNA）的研究仍属空白。此外，在睾丸发育中发挥重要作用的细胞外基质（extracellular matrix，ECM）和黏着斑信号通路，在牦牛睾丸发育过程中尚未被系统研究。

基于上述背景，本研究对天祝白牦牛0.5岁（青春期前）、2.5岁（青春期）和4.5岁（成年）三个发育阶段的睾丸组织进行了RNA测序，每组6个生物学重复。通过整合差异表达分析与WGCNA，旨在表征睾丸成熟过程中的转录组变化、鉴定与年龄相关的共表达模块和关键枢纽基因，并探究青春期转变背后的生物学通路，特别关注ECM相关信号。

二、主要技术方法

研究人员从甘肃省天祝藏族自治县某商业牧场获取18头健康雄性天祝白牦牛，按年龄分为三组：0.5岁（青春期前，n=6）、2.5岁（青春期，n=6）和4.5岁（成年，n=6）。动物经电击致晕后放血处死，睾丸组织一部分液氮速冻用于RNA提取，另一部分以4%多聚甲醛固定用于组织学检查。总RNA经TRIzol提取后，利用Illumina NovaSeq X Plus平台进行150 bp双端测序。原始读段经fastp质控后，以HISAT2比对至牦牛参考基因组（BosGru_v3.0），StringTie组装转录本，RSEM定量基因表达。差异表达分析采用DESeq2，功能富集分析采用Goatools和SciPy进行基因本体论（GO）和KEGG通路富集。WGCNA采用R包（v1.73）构建共表达网络。组织学分析采用苏木精-伊红（H&E）染色。RT-qPCR验证采用SYBR Green法，以β-actin为内参。

三、研究结果

3.1 睾丸成熟在青春期显著推进

H&E染色显示，0.5岁时曲细精管较小，主要含支持细胞和精原细胞，未见精子细胞，符合青春期前状态；2.5岁时曲细精管直径显著增大，生精上皮包含从精原细胞到延长型精子细胞的完整生殖细胞谱系，表明活跃精子发生启动；4.5岁时睾丸呈现完全成熟形态，生精层排列有序，管腔内富含精子。

3.2 跨发育阶段生成高质量转录组

18个样本平均获得3910万条清洁读段，Q20>99%，Q30>96%，平均比对率93.1%，唯一比对率约79.5%。共检测到21,698个表达基因，占参考基因组注释蛋白编码基因的约87.0%。经预处理后保留11,602个基因用于后续分析。主成分分析（PCA）显示样本按发育阶段清晰分离，PC1解释82.5%方差，将0.5岁组与2.5岁和4.5岁组区分；PC2解释5.9%方差，进一步区分2.5岁与4.5岁组。组内相关性系数均超过0.92，2.5岁与4.5岁组间转录相似性高于与0.5岁组的相似性。

3.3 青春期转变驱动广泛的转录重编程

两两差异表达分析显示，0.5岁与2.5岁组间鉴定出9646个DEGs（5249个上调，4397个下调）；0.5岁与4.5岁组间鉴定出10,374个DEGs（5578个上调，4796个下调）；而2.5岁与4.5岁组间仅126个DEGs（60个上调，66个下调）。结果表明最广泛的转录重编程发生在青春期前或期间，而从青春期到成年期的基因表达变化相对较少。

3.4 ECM重塑和精子发生通路表征青春期转变

在0.5岁与2.5岁比较中，GO分析显著富集生殖过程、精子发生、精子活力、纤毛组织和微管运动等条目。KEGG分析中黏着斑（校正p=1.28×10^?7）和ECM–受体相互作用（校正p=8.08×10^?7）为最显著富集通路。对60个ECM相关基因的表达分析显示，从青春期前到青春期，胶原蛋白（如COL4A1、COL4A2、COL6A1、COL6A2）、层粘连蛋白（LAMA1、LAMB1、LAMC1）、整合素（ITGAV、ITGB5、ITGA9）、基质金属蛋白酶（MMP2、MMP14）及其组织抑制剂（TIMP1、TIMP2、TIMP3）等ECM相关基因呈现协调性下调。

3.5 WGCNA鉴定与年龄相关的共表达模块

WGCNA以β=20为软阈值（无标度拓扑拟合指数R²=0.8667），鉴定出7个共表达模块，大小从67到5883个基因不等。经Bonferroni校正后，turquoise模块与0.5岁组呈最强负相关（r=?0.818，p=3.0×10^?5），与4.5岁组呈最强正相关（r=0.704，p=1.1×10^?3）；blue模块呈相反模式。turquoise模块富集精子发生、精子鞭毛组装、受精和能量代谢相关基因；yellow、blue和brown模块富集RNA加工和转录调控相关基因。

3.6 与睾丸成熟相关的关键枢纽基因

turquoise模块（5883个基因）中|kME|>0.99的枢纽基因包括SPATA6（kME=0.997）、SPMIP11（kME=0.997）、TNP1（kME=0.990）、ODF1（kME=0.999）和PGK2（kME=0.999），这些基因参与精子头尾连接组装、鞭毛微管复合物形成、组蛋白向鱼精蛋白转变和精子外层致密纤维形成。yellow模块（334个基因）与年龄负相关，富集信号转导和转录调控相关基因。

3.7 RT-qPCR验证候选基因表达模式

RT-qPCR验证了6个候选DEGs（SPATA6、TNP1、COL4A1、COL6A1、FN1、ITGAV），其中1个样本因RNA质量不佳被排除，最终17个样本纳入分析。单因素方差分析显示SPATA6（F=9.77，p=0.0022）、TNP1（F=7.25，p=0.0069）和COL4A1（F=9.46，p=0.0025）在发育阶段间差异显著。Tukey HSD事后检验表明SPATA6和TNP1在0.5岁至2.5岁及0.5岁至4.5岁间显著上调，COL4A1显著下调，而2.5岁与4.5岁组间无显著差异。RT-qPCR与RNA-seq的log₂倍数变化呈高度一致（Pearson r=0.991，p<0.001）。

四、讨论与结论

讨论部分指出，本研究通过整合差异表达分析与WGCNA，在单一品种跨三个发育阶段、每组6个生物学重复的设计下，提供了牦牛睾丸成熟的网络级视角。研究发现青春期前至青春期存在约77倍的DEG数量差异，提示精子发生的转录程序主要在青春期建立并随后保持相对稳定，这一模式与牛和羊中的报道一致，可能是反刍动物保守的发育特征。

研究人员提出ECM重塑和黏着斑信号通过三种相互关联且非互斥的机制促进牦牛青春期睾丸成熟：第一，BTB在青春期建立，ECM组分与支持细胞上的整合素受体相互作用，调控紧密连接蛋白的磷酸化和组织，黏着斑激酶（FAK）对维持BTB完整性至关重要；第二，生殖细胞从基底部室向腔部室迁移需要支持细胞–生殖细胞界面黏附相互作用的持续重塑，FAK和整合素连接激酶（ILK）将ECM信号传递至肌动蛋白细胞骨架；第三，曲细精管直径的显著增大伴随基底膜的大量重塑，涉及基质金属蛋白酶对原有基质成分的降解和支持细胞及管周肌样细胞合成新ECM蛋白。

研究局限性包括：批量RNA-seq无法确定ECM相关转录本的细胞来源；分析本质上是相关性研究，需蛋白水平和功能实验验证；组织学表征为定性而非定量；所有样本采集于寒冷季节，季节性对基因表达的影响需进一步研究；RT-qPCR仅验证了6个基因且其中3个ECM基因未达显著差异；RNA-seq与qPCR的Spearman秩相关较低（ρ=0.771）反映了高倍数变化基因的影响。

结论部分指出，本研究通过组织学、RNA-seq、差异表达分析和WGCNA的整合，全面表征了天祝白牦牛的睾丸成熟过程。结果表明最广泛的分子变化发生在0.5岁至2.5岁的青春期转变期间，而从青春期到成年期转录组变化相对较少。黏着斑和ECM–受体相互作用通路的显著富集提示ECM重塑可能通过支持BTB建立、生殖细胞发育和曲细精管扩张在睾丸成熟中发挥重要作用。WGCNA鉴定出7个与年龄相关的共表达模块，并突出SPATA6、SPMIP11、TNP1和ODF1等与精子细胞分化和成熟相关的枢纽基因。这些发现为理解牦牛睾丸发育的分子机制提供了新见解，并为这一高海拔经济重要物种的繁殖研究建立了多组学基础。该论文发表于《Animals》期刊。