《Cell Reports Methods》：highSpaClone enables copy number alteration inference and tumor subclone analysis for high-resolution spatial transcriptomics
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高分辨率空间分辨转录组学（spatially resolved transcriptomics, SRT）为研究肿瘤异质性提供了前所未有的机遇，但也带来了巨大的计算和分析挑战。在此，研究人员提出了highSpaClone，一种从多空间尺度的高分辨率SRT数据中
高分辨率空间分辨转录组学（spatially resolved transcriptomics, SRT）为研究肿瘤异质性提供了前所未有的机遇，但也带来了巨大的计算和分析挑战。在此，研究人员提出了highSpaClone，一种从多空间尺度的高分辨率SRT数据中进行拷贝数改变（copy number alteration, CNA）推断和肿瘤亚克隆鉴定的计算框架。通过将空间约束整合到CNA估计和克隆聚类中，highSpaClone使邻近的空间位置能够共享信息，从而提高了基因组信号的稳健性和亚克隆划分的准确性。在多个Xenium和Visium HD数据集中，highSpaClone揭示了独特的转录程序、克隆演化轨迹和不同的肿瘤-微环境相互作用。此外，在人类结直肠癌样本中，highSpaClone在组织学正常的上皮区域检测到CNA事件，突显了与区域癌化（field cancerization）相关的早期基因组改变。这些发现确立了highSpaClone作为研究克隆结构和肿瘤演化的可扩展框架。
肿瘤异质性（tumor heterogeneity）是癌症的基本标志之一，同一病灶内不同肿瘤细胞的行为差异深刻影响治疗应答与耐药性发展。拷贝数改变（copy number alteration, CNA）是癌细胞中体细胞拷贝数变化的主要形式，可作为区分肿瘤亚克隆的稳定基因组标志。空间分辨转录组学（spatially resolved transcriptomics, SRT）技术（如Xenium和Visium HD）能以单细胞和亚细胞分辨率解析基因表达，但其数据具有稀疏性强、规模庞大、部分平台基因覆盖度有限等特点，给CNA推断带来巨大挑战。现有工具如inferCNV和CopyKAT最初为单细胞RNA测序设计，未整合空间背景；CalicoST需要等位基因级输入；SlideCNA主要针对Slide-seq样数据。因此，亟需可扩展且有效整合空间信息的计算方法，以从高分辨率SRT数据中准确推断CNA并识别肿瘤亚克隆。研究人员开发了highSpaClone，通过整合转录组与空间邻近信息增强CNA推断精度，并利用匹配的scRNA-seq数据进行基因插补以实现全基因组覆盖。在多个Xenium和Visium HD数据集中，highSpaClone识别的肿瘤亚克隆与病理注释高度一致，并揭示了独特的转录程序、克隆演化轨迹和肿瘤-微环境相互作用。该研究发表于《Cell Reports Methods》，确立了highSpaClone作为研究克隆结构和肿瘤演化的可扩展框架。
highSpaClone采用以下关键技术：（1）对低覆盖度SRT平台（如Xenium），利用匹配或生物学相关的scRNA-seq参考数据进行Tangram基因插补，将基因覆盖扩展至全基因组；（2）对表达矩阵进行染色体排序、三角加权移动平均平滑及基因组区间降采样预处理；（3）构建整合表达重建项与图拉普拉斯空间平滑约束的目标函数，采用分块Gauss–Seidel迭代策略联合优化CNA矩阵与亚克隆标签；（4）通过平均轮廓指数自动确定最优亚克隆数；（5）使用RCTD进行细胞类型反卷积、Slingshot推断演化轨迹。样本来源包括公开的人类乳腺癌Xenium与Visium HD数据集、三例人类结直肠癌Visium HD数据集及一例来自堪萨斯大学医学中心的既往未发表乳腺癌Xenium样本。
**highSpaClone overview**
highSpaClone通过联合建模CNA（定义遗传上不同的肿瘤亚克隆）与空间邻近性（反映相关亚克隆在肿瘤微环境内聚集的倾向），为单个细胞分配亚克隆标签并重建整个组织切片的空间CNA景观。算法在高效优化框架中实现，可扩展至数十万至数百万细胞或bin规模的数据集。
**Human breast cancer 10× Xenium data 1**
在包含167,780个细胞和313个基因的乳腺癌Xenium数据集中，经Tangram插补至27,460个基因后，highSpaClone的亚克隆划分与病理注释高度一致（ARI=0.82），相对inferCNV（ARI=0.19）和IRIS（ARI=0.29）分别提升332%和183%。CNA分析显示三个亚克隆（两个导管原位癌DCIS和一个浸润癌）存在广泛的拷贝数改变；伪时间分析提示DCIS区域出现较早，浸润区域随后从肿瘤核心向外扩展。DCIS #2在CNA谱和通路富集（EMT、KRAS信号）上处于DCIS #1与浸润癌之间的中间状态，提示其可能是DCIS向浸润癌演进过程中的浸润前亚群。
**Human breast cancer 10× Xenium data 2**
在包含33,860个细胞和380个基因的HER2阳性DCIS伴浸润性导管癌（IDC）Xenium数据集中，highSpaClone以近乎完美的精度区分DCIS与IDC（ARI=0.989）。值得注意的是，DCIS亚克隆的CNA负担高于浸润亚克隆，提示基因组不稳定性可早于明显侵袭。伪时间分析支持从DCIS到IDC的时间性过渡。转录分析显示IDC向腔上皮-HER2表型特化，而DCIS维持更异质性的转录状态，含基底角蛋白、免疫相关和干性相关基因。
**Human breast cancer 10× Visium HD data**
在包含119,082个16-μm bin和18,058个基因的乳腺癌Visium HD数据集中，平均轮廓指数确定最优亚克隆数为3。三个亚克隆呈现不同空间分布和生物学程序：克隆1位于肿瘤核心，富含代谢活性信号；克隆2位于中央肿瘤区，呈现低氧和炎症应激适应表型；克隆3位于肿瘤-间质界面，免疫活性最强，且周围区域三级淋巴结构（TLS）评分最高。多分辨率分析显示8-μm与16-μm结果高度一致，而极端稀疏的2-μm bin信号明显减弱。
**Human CRC 10× Visium HD data**
在三例结直肠癌Visium HD样本中，highSpaClone在肿瘤周围组织学正常的肠上皮区域检测到低幅度CNA事件，CNA评分随距肿瘤距离增加而降低，提示区域癌化（field cancerization）现象。三例样本呈现显著不同的CNA景观：P1CRC和P5CRC以广泛染色体缺失为主并伴有局灶性癌基因扩增，P2CRC则以多染色体扩增为主，包括含有MYC和CCNE2的chr8扩增。
**Orthogonal validation using spatial FISH data**
在前列腺癌Visium数据集中，highSpaClone恢复的CNA模式与FISH验证的MYC扩增（chr8q）和PTEN缺失（chr10p）一致，为转录组推断的CNA信号提供了独立的DNA水平支持。
讨论部分指出，highSpaClone与病理注释的一致性应理解为CNA定义的亚克隆与组织学区域的一致性，而非形态学与基因组状态的等同。结直肠癌中CNA阳性良性上皮细胞为区域癌化提供了高分辨率空间证据。参考细胞选择对CNA推断质量至关重要，肿瘤细胞污染会削弱信号对比度。未来工作方向包括整合单细胞DNA测序和多组学空间检测、优化插补策略、纳入等位基因特异性信息及改进稀疏平台的适应性分箱策略。局限性包括Tangram插补可能无法完全恢复天然转录组、CNA推断受测序深度制约、极端稀疏的2-μm bin不适宜直接推断、转录组推断的CNA仍属间接测量。研究结论：通过将静态的表达图谱转化为基因组不稳定性的动态读数，highSpaClone为解析肿瘤异质性、重建演化轨迹提供了强大框架。随着空间转录组学技术的不断进步，highSpaClone的持续开发与应用有望优化患者风险分层，并在空间癌症基因组学时代推动精准肿瘤学的发展。
