《Diabetes, Metabolic Syndrome and Obesity》：Effects of Acetylcholine on Endothelial Function and Nitric Oxide Levels in Patients with Type 2 Diabetes Mellitus: A Randomized Sham-Controlled Study
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背景：周围神经病变是一种多病因的常见神经系统疾病。神经损伤常因长期高血糖及糖尿病而发生。周围神经纤维损伤主要通过一氧化氮合酶（Nitric Oxide Synthase, NOS）活性失调介导，诱导不可逆的结构损伤。乙酰胆碱（Acetylcholine, Ac
背景：周围神经病变是一种多病因的常见神经系统疾病。神经损伤常因长期高血糖及糖尿病而发生。周围神经纤维损伤主要通过一氧化氮合酶（Nitric Oxide Synthase, NOS）活性失调介导，诱导不可逆的结构损伤。乙酰胆碱（Acetylcholine, Ach）通过刺激内皮一氧化氮（Nitric Oxide, NO）产生引起血管舒张，从而松弛平滑肌，并触发神经轴突反射。该反射释放P物质（Substance P）等神经肽，进一步扩张血管并促使组胺释放。本研究旨在评估乙酰胆碱（Ach）离子电渗疗法作为血管扩张剂对内皮NOS活性的影响，以开发一种有效且无全身性不良副作用的无创经皮治疗方法。
方法：八十名确诊为2型糖尿病（Type 2 Diabetes Mellitus）的男性和女性患者被随机分为两组。实验组（A组）接受乙酰胆碱离子电渗疗法，每次15分钟，每周三次，持续四周。对照组（B组）接受假离子电渗疗法，每次15分钟，每周三次，持续四周。两组均在治疗前后评估一氧化氮水平及周围神经的神经传导研究。
结果：该研究表明，与B组相比，A组在内皮依赖性血管舒张和一氧化氮（NO）水平方面有统计学显著改善。然而，在周围神经和肌肉的电生理结果方面，两组在治疗前后均未观察到显著差异。
结论：重复乙酰胆碱离子电渗疗法显著改善了糖尿病神经病变患者的微血管功能，增加了一氧化氮释放和组织灌注。尽管未观察到周围神经传导的即时变化，该干预措施作为支持糖尿病神经病变并发症中微血管健康的辅助策略显示出前景。
论文解读：乙酰胆碱离子电渗疗法对2型糖尿病神经病变患者内皮功能与一氧化氮水平的影响
一、研究背景与目的
糖尿病神经病变（Diabetic Neuropathy）是糖尿病最常见的慢性并发症之一，影响全球数亿糖尿病患者。长期慢性高血糖通过多种机制导致周围神经不可逆的结构损伤，包括节段性脱髓鞘及有髓和无髓神经纤维的退行性变。神经损伤的病理过程主要涉及一氧化氮合酶（Nitric Oxide Synthase, NOS）活性的失调。在糖尿病状态下，一氧化氮（Nitric Oxide, NO）通路在临床上明显的大血管病变出现之前即已存在异常，导致内皮功能障碍。周围神经血流减少是糖尿病中观察到的最早功能异常之一，局部神经缺氧被认为是神经病变发展的关键致病因素。
血管内皮通过释放影响血管舒张和收缩的物质在微血管张力调节中发挥关键作用。NO是内皮依赖性舒张中的主要血管扩张剂，由内皮细胞以L-精氨酸为底物经NOS催化合成，扩散至邻近平滑肌细胞后激活鸟苷酸环化酶，促使环磷酸鸟苷（cyclic Guanosine Monophosphate, cGMP）合成，从而介导平滑肌松弛和血管舒张。乙酰胆碱（Acetylcholine, Ach）通过两种内皮依赖性机制诱导微循环血管舒张：其一为Ach与内皮细胞上的毒蕈碱受体结合，激活NOS并利用L-精氨酸刺激NO产生；其二为Ach介导C-伤害性纤维（C-nociceptive fibers）激活，触发Lewis三重反应，即神经轴突反射介导的血管舒张。该反射增强P物质（Substance P）和降钙素基因相关肽（Calcitonin Gene-Related Peptide, CGRP）的释放，P物质刺激肥大细胞释放组胺，CGRP直接引起血管舒张，产生间接的血管舒张效应。
既往研究主要将乙酰胆碱离子电渗疗法作为诊断工具，用于评估内皮依赖性微血管反应性。然而，其作为重复治疗性干预以调节微循环功能的潜在应用尚未被系统研究，尤其是在糖尿病神经病变患者中。因此，本研究旨在评估重复乙酰胆碱离子电渗疗法作为血管扩张剂对内皮NOS活性的影响，探讨其是否能诱导可测量的生化、微血管及功能性神经生理学变化，以开发一种有效且无全身性不良副作用的无创经皮治疗方法。研究人员假设，重复乙酰胆碱离子电渗疗法将显著增加2型糖尿病（Type 2 Diabetes Mellitus）患者的NO生物利用度并增强微循环参数，并进一步探讨微血管功能的改善是否会在四周内导致周围神经传导和电生理结果的继发性增强。
二、研究设计与方法
该研究为一项主动对照随机研究，共纳入80名经临床诊断为糖尿病多发性神经病变的2型糖尿病患者，患者来源于南谷大学医院（South Valley University Hospital）内科门诊，入组时间为2024年4月至2024年12月。研究已在临床试验注册平台注册（注册号NCT06219590），并获得南谷大学伦理委员会批准（伦理批号P.T-BAS-06/2023-515）。所有参与者均签署知情同意书。研究遵循《赫尔辛基宣言》及CONSORT指南报告。
参与者年龄介于40至60岁，确诊2型糖尿病超过10年。采用计算机生成的随机序列进行简单随机化分组，分配方案置于按顺序编号、不透明、密封的信封中，由不参与干预或数据收集的独立研究人员开启。研究采用双盲设计：对照组接受假离子电渗疗法（使用相同设备及时长，但不施加有效电流且不使用乙酰胆碱）以维持参与者盲态；进行神经传导研究和一氧化氮分析的评估者对分组情况保持盲态。
实验组（A组，n=40）接受乙酰胆碱离子电渗疗法，乙酰胆碱浓度为每100 cm2无菌生理盐水中含1 mg，即1%浓度，每次治疗15分钟，每周三次，持续四周。对照组（B组，n=40）接受假离子电渗疗法，设备通电但仅施加电流，每次15分钟，每周三次，持续四周。为防止皮肤刺激，两组电流强度维持在3–5 mA，每3–5分钟检查皮肤有无红斑或刺激迹象。两组均接受常规药物治疗和健康饮食。
治疗设备采用ASTAR Swit 33, 43–382双通道刺激器（波兰别尔斯科-比亚瓦）。离子电渗疗法采用低电压直流电将离子化化合物（1%乙酰胆碱）递送至软组织。由于乙酰胆碱携带正电荷，通过阳极（主动电极）给药。主动电极包含一个带有半透膜的腔室，容纳乙酰胆碱溶液，置于腿部腓骨头外侧以靶向腓总神经。无关电极置于足背以完成电路。
结局指标包括：血清NO水平（实验室检测）、神经传导研究（Nerve Conduction Study, NCS）及激光多普勒血流测定。NCS方案由一位研究人员执行，对单侧下肢进行检测，包括腓总神经运动传导和腓肠神经感觉传导等。样本量使用G*Power软件（3.1.9.7版）计算，基于混合因素多元方差分析（MANOVA）全局效应，预期Pillai's V效应量为0.15（对应Cohen's f2(V)=0.18），显著性水平α=0.05，检验效能1-β=0.90，所需样本量为68名（每组34名）。考虑15%的失访率，最终纳入80名参与者（每组40名）。统计分析采用非配对t检验比较两组参与者特征，Shapiro–Wilk检验评估数据正态性，Levene检验评估方差齐性，双因素混合MANOVA分析组内和组间效应，Bonferroni校正处理多重比较，显著性阈值设为p<0.05，使用SPSS 25.0版软件进行分析。
三、研究结果
参与者基本特征： 共80名诊断为周围神经病变的患者入组。A组和B组参与者在年龄、体重、身高和体重指数（Body Mass Index, BMI）方面无显著差异（p>0.05）。
一氧化氮水平： 混合MANOVA显示显著的组别×时间交互作用（F=266.70，p=0.001），时间和组别的主效应均显著。实验组（A组）治疗后NO水平增加25.12%（p<0.001），而对照组（B组）无变化。研究表明，A组NO水平的改善显著大于B组（25.12%对比0.20%），NO均值达到55.8 mmol/L。
血流灌注： 在室温（30°C）条件下，实验组基线灌注从7.6增至24.6，乙酰胆碱离子电渗诱导的灌注从25.2增至69.7。对照组基线灌注从4.0增至11.7，假乙酰胆碱离子电渗诱导的灌注从15.0增至33.1。结果表明实验组治疗后微循环灌注的增强更为显著。
神经传导研究： 两组在周围神经的潜伏期、波幅和传导速度方面，治疗前后均未观察到统计学显著差异。神经传导研究评估结果与健康个体正常范围相比无改善。
四、讨论与结论
本研究与既往研究不同之处在于，既往研究主要利用激光多普勒成像系统评估皮肤微血管对离子电渗递送乙酰胆碱和局部加热的反应，而本研究直接量化微血管舒张的主要介质NO，并证明内皮依赖性血管舒张性NO存在显著的组间差异，有利于实验组。这一发现提示神经病变与微循环损害之间存在病理生理学联系。NO生物利用度的增加可增强血管舒张和组织灌注，改善氧合和营养输送，从而改善组织活力。
研究中未观察到神经传导速度的统计学显著差异。这归因于乙酰胆碱离子电渗疗法对完整C-伤害性纤维的依赖性。糖尿病神经病变患者中，C-伤害性纤维已存在功能损害，导致轴突反射介导的血管舒张反应（flare反应）显著降低，尤其在神经病变足部最为明显。局部麻醉剂阻滞在对照组中减少了血管舒张，但在神经病变患者中几乎没有额外影响，表明存在预先存在的C纤维损伤。功能性血管改善可能反映了内皮反应性和微血管调节的增强，可能改善组织灌注并减少氧化应激，但此类内皮变化不应被解释为即时结构性神经恢复的证据。神经再生和功能恢复涉及复杂的、时间依赖的重塑过程，血管增强可能提供支持性生物学环境，但不一定在短期内转化为结构性或临床改善。
既往研究表明，微循环受损与内皮型一氧化氮合酶（endothelial Nitric Oxide Synthase, eNOS）和聚（ADP-核糖）聚合酶（Poly (ADP-Ribose) Polymerase, PARP）表达降低相关。训练可诱导NO释放，这与增强的激光多普勒血流仪（Laser Doppler Flowmetry, LDF）反应相关，可能源于NOS上调或NOS活性增加。有氧适能通过增加NOS活性影响去甲肾上腺素能交感纤维在热诱导NO产生中的功能，这可能与有氧运动期间施加于内皮的重复剪切应力有关。
本研究的局限性在于干预周期仅为4周，随后在6周后进行评估，未评估长期效应，未来需要纵向研究来弥合这些急性生理变化与持续功能恢复之间的差距。
研究结论： 重复乙酰胆碱离子电渗疗法显著改善了2型糖尿病患者的微血管功能，增加了一氧化氮释放和组织灌注。尽管未观察到周围神经传导的即时变化，该干预措施作为支持糖尿病神经病变并发症中微血管健康的辅助策略显示出前景。
