线粒体靶向秦皮素通过协同激活AMPK-SIRT1通路并抑制p38 MAPK信号通路减轻年龄相关性心脏重构

《Biochemical and Biophysical Research Communications》：Mitochondria-targeted esculetin mitigates age-associated cardiac remodeling through coordinated activation of AMPK-SIRT1 and inhibition of p38 MAPK signaling

　　

摘要 年龄相关的心室重构以心肌肥厚和纤维化为特征，是老年人心血管疾病发病的重要原因，并常因高胆固醇血症等代谢应激因素而加重。鉴于线粒体功能障碍在这些过程中的核心作用，我们研究了靶向线粒体的秦皮乙素（Mito-Esc）能否缓解与衰老和高胆固醇血症相关的病理性心室重构。为模拟这一状态，我们使用了12月龄的Apoe-/-小鼠，该模型表现出慢性高胆固醇血症并发展出年龄相关的心肌代谢结构改变。我们比较了Mito-Esc与一种潜在的抗衰老药物二甲双胍的疗效。在老年Apoe-/-小鼠中，Mito-Esc或二甲双胍处理显著减轻了心肌肥厚、纤维化、炎症和氧化应激。这些保护作用在体外使用H9c2心肌细胞和原代成年小鼠心肌成纤维细胞中得到进一步验证。机制上，Mito-Esc和二甲双胍均通过激活AMPK-SIRT1信号轴发挥心脏保护作用。敲低AMPK或SIRT1均可显著降低这些化合物抑制细胞衰老、肥厚反应和纤维化信号的能力，表明该通路具有关键作用。AMPK位于SIRT1的上游，因为AMPK敲低后SIRT1的激活减弱。同时，两种化合物均显著抑制了p38 MAPK的激活。尽管AMPK或SIRT1的敲低不影响p38 MAPK活性，但药理学抑制p38 MAPK可增强AMPK和SIRT1的激活，支持了p38 MAPK激活负向调控AMPK-SIRT1轴这一模型。总之，这些发现表明Mito-Esc通过协同激活AMPK-SIRT1信号通路和抑制p38 MAPK，缓解了衰老和高胆固醇血症条件下的病理性心室重构。 引言 心肌肥厚是心脏结构重构的标志，其特征为心肌增大和增厚，在细胞水平表现为细胞体积增大和蛋白质合成增强[1]。生理性肥厚是可逆的，主要由适应性刺激引起，如耐力训练或妊娠；而病理性肥厚则由不良刺激引发，如高血压、心肌梗死或异常血流动力学应力[2], [3], [4]。与此类似，心肌纤维化以细胞外基质（ECM）蛋白如胶原蛋白的过度沉积为特征，导致心肌僵硬、电传导异常和收缩功能受损[5]。 衰老和高胆固醇血症是心血管疾病的重要且常共存的危险因素[6]。在Apoe-/-小鼠中，慢性高胆固醇血症与衰老共同导致代谢改变，加剧炎症、心肌肥厚和纤维化，减少心肌生成并升高心肌细胞凋亡[7], [8]。暴露于缺氧条件的小鼠心肌成纤维细胞表现出衰老相关标志物如p21、p53、p16和SA-β-Gal水平升高，以及肌成纤维细胞标志物如α-SMA和DDR2表达增加[9]。与此一致，小鼠研究显示衰老加重心肌肥厚，老龄Rap1-/-小鼠表现出显著的肥厚表型[10]。大量证据强调衰老与氧化应激之间存在双向相互作用，两种过程相互加重[11], [12]。此外，在老龄人和大鼠心脏中观察到与活性氧（ROS）稳态相关基因表达显著下降[13]。先前的研究还表明过量的线粒体ROS有助于心脏肥厚和纤维化的发生[14], [15]。然而，常规的非靶向抗氧化疗法在清除线粒体来源ROS（mROS）方面的疗效有限，这凸显了需要专门将抗氧化剂递送至线粒体的策略，以治疗那些线粒体功能障碍因过量ROS产生而起关键作用的疾病病理状态。靶向线粒体的抗氧化剂，如靶向线粒体的过氧化氢酶（mCAT），已展示了其潜力，通过减轻小鼠心脏衰老并减少年龄相关的肥厚和纤维化[16]，表明靶向线粒体的抗氧化剂优于非靶向抗氧化剂。基于这一概念，我们最近合成了新型靶向线粒体化合物Mito-Esc，通过将天然抗氧化香豆素秦皮乙素与脂溶性三苯基磷鎓阳离子（TPP+）偶联而成。高度负值的线粒体膜电位促进了TPP+偶联分子在线粒体区室的优先积累。虽然秦皮乙素本身在减轻动脉粥样硬化和减少血管紧张素诱导的心肌纤维化方面已显示出前景[17], [18]，但其生物利用度较差限制了治疗效能。我们此前已证明，与母体秦皮乙素不同，Mito-Esc通过调节AMPK-SIRT1信号轴有效缓解年龄相关的动脉粥样硬化[19]，并通过增强AMPK介导的一氧化氮（NO）调节改善内皮功能[20], [21]。 二甲双胍是一种已知的腺苷单磷酸激活蛋白激酶（AMPK）激活剂，其心脏保护效应已被广泛研究。我们此前的研究表明，二甲双胍通过AMPK介导的SIRT1激活延缓年龄相关的血管功能障碍[22]，并通过促进AMPK依赖的脂肪酸β-氧化减轻心脏重构[23]。这些研究结果与二甲双胍通过AMPK减轻心肌肥厚和纤维化的能力一致[24], [25]。此外，应激诱导的p38丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路也与心脏病理有关。p38 MAPK的激活已被证明可诱导纤维化和心力衰竭[26]，而其抑制可改善小鼠模型心肌梗死后的心脏功能[27]。尽管AMPK和SIRT1各自均被认可为心脏保护性调节因子，但这些通路与应激激活的p38 MAPK信号通路在年龄相关心室重构过程中的功能层级和整合方式仍不完全明确。 由于年龄相关的心室重构是一个涉及多种病理刺激和细胞类型的复杂过程，在本研究中，我们使用了互补的实验体系来考察整合的心脏表型及其潜在的细胞机制。12月龄的Apoe-/-小鼠模型用于在衰老和慢性代谢应激的背景下研究心脏重构，而异丙肾上腺素处理的H9c2心肌母细胞和TGF-β处理的原代心肌成纤维细胞则作为简化模型分别用于考察心脏重构的肥厚和纤维化组分。这些细胞模型并非旨在重现Apoe-/-心脏的完整病理生理环境，而是旨在确定与Mito-Esc在体内心脏保护效应相关的分子通路能否在不同类型心脏细胞中进行机制性重现。研究特别关注AMPK-SIRT1和p38 MAPK通路，因为这些通路在老年心脏和细胞模型中均持续发生改变。我们的发现表明，Mito-Esc和二甲双胍减轻了老年Apoe-/-小鼠的心肌肥厚和纤维化，并减少了心肌母细胞和心肌成纤维细胞中相应的病理性反应。这些效应与AMPK-SIRT1的激活、p38 MAPK的抑制以及细胞应激反应的改善相关。 实验部分 辛基TPP+偶联秦皮乙素（Mito-Esc）的合成 Mito-Esc的合成方法如前所述[28]。 细胞培养 大鼠心肌母细胞（H9c2）购自ATCC（美国弗吉尼亚州曼纳萨斯），并在DMEM培养基中（37°C，5% CO?），补充10% FBS（货号12800017，GIBCO，英国佩斯利）进行培养。 成年小鼠心肌成纤维细胞分离 C57BL/6小鼠（6-8周龄）经颈椎脱臼处死，经PBS灌流后收集心脏。去除心房后，将心室切碎并用胶原酶II（2 mL/心脏；货号C6885，Sigma）在…（此处文本截断） 讨论 衰老是心血管疾病（包括心肌肥厚和纤维化）发展的不可避免的因素。随着增龄，心脏功能逐渐下降，这与细胞成分改变、心肌细胞凋亡增加以及心脏干细胞池中心肌细胞再生减少有关[36]。了解这些变化并实施预防病理性心室重构的策略对于维持整体健康至关重要。 在本研究中…（此处文本截断） CRediT作者贡献声明 Yogesh Chandra：调查研究，形式分析。Sai Krishna Ganji：方法学，形式分析。Rajamannar Thennati：方法学。Srigiridhar Kotamraju：论文撰写—审阅与编辑，验证，监督，软件，资源，项目管理，资助获取，形式分析，数据管理，概念化。Hridya Chempon：论文撰写—原始稿，可视化，验证，方法学，调查研究，形式分析，数据管理，概念化。Sriravali Pulipaka：（此处截断） 伦理声明 本研究按照以下动物福利指南和/或报告规范进行：印度医学研究理事会（ICMR）；实验在CPCSEA（动物实验控制与监督委员会）注册的机构中进行。本研究经印度化学技术研究所印度理工学院（CSIR-IICT）批准。（批准号IICT/IAEC/024/2022和IICT/IAEC/040/2023） 利益冲突声明 作者声明，描述Mito-Esc生物特性的专利和专利申请，发明人为HC、SP、AS、RT和SK，归属于CSIR。 数据可用性 支持本研究结果的数据可在合理请求下向通讯作者获取。 伦理审批 本工作中进行的小鼠研究经机构动物伦理委员会审查并批准（IAEC/IICT/024/2022和IAEC/IICT/040/2023），符合在CPCSEA（动物实验控制与监督委员会）注册的动物设施中制定的动物科学研究与使用的指南（印度ICMR）。 资助 本工作得到印度科学与工业研究理事会（OLP-015）资助。 利益冲突声明 ? 作者声明他们不存在已知的可能影响本文所报告工作的竞争性经济利益或个人关系。 致谢： Chempon H、Pulipaka S和Shaikh A感谢印度新德里CSIR颁发的研究奖学金。感谢Muralidharan K博士提供动物和动物实验。感谢印度海得拉巴CSIR-IICT知识与管理信息部门对本稿件进行剽窃检查（IICT/Pubs./2025/388）。 Hridya Chempon | Sriravali Pulipaka | Altah Shaikh | Yogesh Chandra | Sai Krishna Ganji | Rajamannar Thennati | Srigiridhar Kotamraju 印度海得拉巴印度理工学院印度理工学院印度理工学院（500007）应用生物学系