α-突触核蛋白与线粒体通透性转换孔在鱼藤酮诱导的帕金森病模型中的相互作用：环孢素A的神经保护前景

《Biochemistry and Biophysics Reports》：Alpha-synuclein and mitochondrial permeability transition pore interactions in rotenone-induced Parkinson’s disease models: neuroprotective promise of cyclosporine A

　　

背景：鱼藤酮广泛用于建立帕金森病实验模型，但鱼藤酮的各种毒性效应仍未在机制上联系起来以明确神经损伤的通路。方法：研究人员考察了鱼藤酮对大鼠的神经毒性，是否联合使用环孢素A（一种线粒体通透性转换孔（mitochondrial permeability transition pore, mPTP）激活抑制剂），通过黑质神经元死亡和离体中脑线粒体功能障碍来评估。此外，在SH-SY5Y细胞中探讨了α-突触核蛋白（α-synuclein）在鱼藤酮诱导的细胞死亡和线粒体功能障碍中的作用。结果：在大鼠中，鱼藤酮处理后观察到黑质多巴胺能神经元死亡、α-突触核蛋白积累以及中脑线粒体功能改变；环孢素A联合处理可预防神经元死亡和所有线粒体改变（除复合物I-III抑制外），而对α-突触核蛋白积累无明显影响。同样，在SH-SY5Y细胞中，暴露于鱼藤酮48小时可导致细胞死亡和线粒体功能障碍，这些效应被α-突触核蛋白表达的敲低所消除。结论：总体而言，结果提示α-突触核蛋白在引起线粒体功能障碍和神经细胞死亡中发挥关键作用，推测通过mPTP激活实现。此外，环孢素A在帕金森病中可能具有潜在的神经保护作用。

帕金森病（Parkinson’s disease, PD）是最常见的神经退行性疾病之一，其病理特征包括黑质致密部多巴胺能神经元的进行性丢失，以及以α-突触核蛋白（α-synuclein）为主要成分的路易小体（Lewy bodies）形成。PD的发病机制尚未完全阐明，但氧化应激、线粒体功能障碍和α-突触核蛋白蓄积被认为是相互作用的损伤通路。鱼藤酮（rotenone）作为线粒体复合物I抑制剂，广泛用于构建PD动物和细胞模型，可模拟PD的许多病理特征，如运动缺陷、黑质纹状体多巴胺能神经元变性、复合物I抑制、氧化应激和α-突触核蛋白蓄积。然而，鱼藤酮的这些毒性效应在机制上尚未被统一解释，其导致神经损伤的明确通路仍不清楚。研究人员前期在SH-SY5Y细胞中发现，鱼藤酮的细胞毒性并非单纯由复合物I抑制引起，而是主要由线粒体通透性转换孔（mitochondrial permeability transition pore, mPTP）激活导致线粒体生物能量衰竭和活性氧（reactive oxygen species, ROS）生成增加所致，环孢素A（cyclosporine A, CsA）可显著保护细胞。基于此，本研究旨在进一步验证鱼藤酮在大鼠脑内是否也通过mPTP激活发挥毒性，并探讨α-突触核蛋白蓄积是否在线粒体功能障碍和神经元死亡中起上游作用。该研究成果发表于《Biochemistry and Biophysics Reports》。

研究人员建立了鱼藤酮诱导的PD大鼠模型和SH-SY5Y细胞模型。在大鼠中，通过腹腔注射鱼藤酮（1.5 mg/kg，连续8天）处理，并设置环孢素A口服联合给药组；在细胞中，采用siRNA敲低α-突触核蛋白表达。研究发现，鱼藤酮可导致黑质多巴胺能神经元死亡、α-突触核蛋白蓄积及中脑线粒体功能障碍，而环孢素A能显著逆转线粒体功能异常和神经元死亡，但不影响α-突触核蛋白蓄积。在SH-SY5Y细胞中，敲低α-突触核蛋白可完全消除鱼藤酮诱导的细胞死亡和线粒体损伤。这些结果提示，α-突触核蛋白通过激活mPTP引起线粒体功能障碍和神经细胞死亡，环孢素A通过抑制mPTP发挥神经保护作用，可能成为PD治疗的潜在药物。

本研究用到的主要关键技术方法包括：使用Wistar大鼠（雌雄共51只）和SH-SY5Y人神经母细胞瘤细胞系（ATCC）；差速离心和毛地黄皂苷处理分离中脑与纹状体线粒体；测定线粒体呼吸链复合物I-III和II-III活性、线粒体膜电位（JC-1荧光探针）、H₂O₂产生（Amplex Red）和ATP合成（荧光素酶法）；免疫组化检测酪氨酸羟化酶（tyrosine hydroxylase, TH）阳性神经元，免疫荧光检测α-突触核蛋白，碘化丙啶（PI）染色检测神经元死亡；SH-SY5Y细胞转染α-突触核蛋白特异性siRNA敲低表达；细胞死亡检测采用PI/Hoechst 33258双染和乳酸脱氢酶（LDH）释放试验；线粒体功能检测采用TMRE膜电位、ATP含量和MitoSox Red线粒体ROS。

### 3.1 鱼藤酮处理大鼠的线粒体改变：环孢素A的保护作用

通过分离中脑和纹状体线粒体进行体外功能分析发现，鱼藤酮组复合物I-III活性较对照组下降约46%，环孢素A联合治疗未能预防该抑制；复合物II-III活性在三组间无显著差异。然而，鱼藤酮组线粒体膜电位较对照组下降约50%，ROS产生增加约2.3倍，ATP合成减少约55%，环孢素A联合