一种新的mTORC1–NPC2轴机制能够抑制脂质摄取（即脂质吞噬作用），并促进动脉粥样硬化斑块的进展

《Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Basis of Disease》：A novel mTORC1–NPC2 axis suppresses lipophagy and drives atherosclerotic plaque progression

　　• 动脉粥样硬化患者的动脉内皮细胞表现出胆固醇水平升高和脂质吞噬功能受损。
• 在小鼠中，高胆固醇饮食（HCD）诱导的mTOR激活和血管脂质积累可以通过雷帕霉素得到缓解。
• mTOR抑制可以恢复MHY1485处理的内皮细胞中的NPC2表达。
• NPC2缺陷会减弱雷帕霉素对内皮脂质吞噬和脂质稳态的恢复作用。

**引言**
全球范围内，心血管疾病的发病率和死亡率逐年增加。根据世界卫生组织的数据，每年约有1790万人死于心血管疾病，占全球所有死亡人数的32%[1]。动脉粥样硬化（AS）是心血管疾病的主要病理基础，对人类健康构成严重威胁，并带来巨大的社会经济负担[2]。AS是一种由多种因素介导的慢性炎症性动脉疾病，其特征是动脉壁内形成纤维脂肪斑块。随着斑块的进展，可能导致严重的临床事件，如心肌梗死、缺血性中风和外周动脉疾病，使其成为全球主要的死亡原因之一[3]。目前，由于AS的复杂发病机制和隐匿性进展，其治疗仍然是一个重大挑战。因此，深入研究AS的病理生理机制对于开发新的治疗策略、延缓甚至逆转疾病进展以及减轻其总体负担至关重要。

作为慢性疾病，AS的病理机制涉及多个方面，主要包括血脂异常[4]、内皮细胞损伤和死亡[5]以及炎症和免疫功能障碍[6]。其中，内皮功能障碍和炎症反应在AS的发生和发展中起着关键作用[7]。血管内皮是一层覆盖在血管内壁的上皮细胞，作为血液与血管壁之间的物理屏障，对维持血管稳态至关重要。一旦内皮细胞受损或死亡，会导致血管屏障功能受损、异常的血管收缩和扩张、平滑肌细胞的增殖和迁移、炎症反应加剧以及血栓形成[8]。此外，动脉粥样硬化斑块中的内皮损伤会进一步促进斑块的不稳定、破裂和继发性血栓形成，从而加速AS的进展[9]。因此，减轻内皮细胞损伤已成为逆转动脉粥样硬化病变的重要策略。

动脉粥样硬化是一种以动脉壁内脂质持续积累为特征的进行性疾病[10]。高胆固醇血症可以诱导内皮细胞损伤，并激活巨噬细胞吞噬内膜下的脂质，将其转化为难以降解的泡沫细胞。同时，它还会促进平滑肌细胞的迁移和增殖，导致血管壁变薄、腔道进一步狭窄[11][12]。动脉壁中的胆固醇沉积是AS形成的初始事件，其消退取决于斑块中的胆固醇清除和/或炎症的缓解。自噬被认为调节巨噬细胞泡沫细胞中的脂质滴清除和胆固醇外流，这一过程被称为“逆向胆固醇运输”，具有抗动脉粥样硬化的作用[13]。脂质吞噬是指通过溶酶体选择性降解脂质滴的过程，通过释放脂肪酸来维持细胞内的能量代谢稳态[14]。最新研究表明，泡沫细胞中的脂质吞噬功能受损，表明脂质吞噬功能障碍与动脉粥样硬化密切相关[15]。

NPC2（Niemann-Pick C2型蛋白）是一种溶酶体胆固醇转运蛋白，在脂质的细胞内转运和代谢中起关键作用，尤其是胆固醇[16]。NPC1（Niemann-Pick C1型蛋白）主要负责溶酶体膜上的胆固醇跨膜转运，并与NPC2协同作用，调节胆固醇从溶酶体向其他细胞器的转运[17]。在高胆固醇环境中，胆固醇转运机制失调会导致溶酶体内未酯化胆固醇的异常积累，而其他细胞器中的酯化胆固醇供应不足。这进而导致溶酶体功能障碍和自噬异常，破坏细胞稳态。

mTOR（雷帕霉素的靶标）作为细胞代谢调节的中心枢纽，整合来自营养、能量和生长因子的信号，并直接参与胆固醇的合成、摄取、储存和外排[18]。溶酶体胆固醇转运和mTORC1活性功能上相互耦合。NPC1/NPC2依赖的胆固醇转运紊乱会改变溶酶体mTORC1信号传导，而持续的mTORC1激活则会抑制自噬，可能加剧脂质积累和降解功能障碍[19][20]。

本研究探讨了mTOR–NPC2与动脉粥样硬化中内皮脂质吞噬的调节关系。通过整合转录组学和蛋白质组学分析确定了候选通路。使用接受或未接受雷帕霉素处理的高胆固醇饮食（HCD）小鼠以及经过药物调节mTOR的HAoECs（人主动脉内皮细胞）进行实验验证。通过GST pull-down和分子对接来评估mTOR与NPC2之间的潜在关联，并使用NPC2敲除细胞来评估NPC2是否参与雷帕霉素诱导的脂质稳态恢复。

**研究对象**
共招募了30名接受颈动脉内膜切除术的动脉粥样硬化患者和30名健康对照组。健康对照组仅提供外周血样本。该研究获得了浙江省人民医院伦理委员会的批准（批准编号2020QT257），所有参与者均签署了书面知情同意书。纳入标准包括：（1）符合《颈动脉狭窄诊断和治疗指南》中规定的手术指征；（2）有HAoECs培养物。

**HAoECs培养**
HAoECs培养基通过向93%的内皮细胞培养基（ECM）中添加5%的胎牛血清（FBS）、1%的内皮细胞生长补充剂（ECGS）和1%的青霉素-链霉素（双重抗生素）制备而成。细胞接种到T-25培养瓶中，在37°C、5% CO?的湿润培养箱中培养。

**exosome处理**
从组织中分离出的exosome被添加到HAoECs中。通过CCK-8试验评估HAoECs细胞的活性。

**动物模型和雷帕霉素处理**
8周大的C57BL/6小鼠适应1周后，随机分配到正常饮食（ND）、高胆固醇饮食（HCD）和HCD加雷帕霉素（HCD+Rapa）组（每组6只）。ND组的鼠粮为标准实验室饮食，而HCD和HCD+Rapa组的鼠粮含有40%的热量来自脂肪和1.25%的额外胆固醇，持续12周。在最后4周，HCD+Rapa组的小鼠接受4 mg/kg的雷帕霉素治疗。

**细胞处理和NPC2敲除**
HAoECs培养至约70%–80%汇合度后进行处理。对于mTOR激活实验，细胞用10 μM MHY1485处理24小时，而对照组细胞则接受等体积的二甲基亚砜。对于mTOR抑制实验，细胞单独用10 μM MHY1485处理24小时，或同时用10 μM MHY1485和100 nM雷帕霉素处理24小时。NPC2敲除HAoECs通过CRISPR/Cas9介导的基因组编辑技术获得。

**qRT-PCR分析**
总RNA使用Trizol试剂从HAoECs中提取并反转录为cDNA。定量实时PCR使用SYBR Green检测系统进行。扩增条件为：初始变性95°C 30秒，随后40个循环：95°C 5秒变性、60°C 30秒退火/延伸。β-Actin作为内参基因。相对NPC2 mRNA表达通过2^-ΔΔCt方法计算。

**细胞染色**
细胞用磷酸盐缓冲 saline洗涤并用4%戊二醛固定15分钟。对于Oil Red O染色，细胞与新鲜制备并过滤的0.5% Oil Red O工作溶液孵育15分钟，然后用蒸馏水洗涤。
对于中性脂质染色，细胞在37°C、黑暗条件下用2 μM BODIPY 493/503孵育30分钟。
对于未酯化胆固醇染色，固定后的细胞在室温下用50 μg/mL Filipin III孵育1小时。

**BODIPY-LAMP1共定位**
细胞先用4%戊二醛固定15分钟，再用0.1% Triton X-100渗透10分钟，然后用5%牛血清白蛋白封闭1小时。细胞在4°C下用1:200稀释度的抗-LAMP1一抗孵育过夜，然后用1:500稀释度的荧光二抗孵育1小时。随后用2 μM BODIPY 493/503染色30分钟，并用DAPI复染。

**Western blot分析**
总蛋白用含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂的RIPA裂解缓冲液提取。蛋白浓度用BCA法测定。等量的蛋白通过SDS-PAGE分离后转移到PVDF膜上。用5%非脂肪牛奶封闭1小时后，在4°C下用针对p-mTOR、mTOR、NPC2、p62、PLIN1和GAPDH的一抗孵育过夜。洗涤后，用相应的二抗孵育。

**统计分析**
数据以平均值±标准差表示。除非另有说明，每个实验独立重复三次。来自同一生物样本的多个显微视野或技术PCR重复结果取平均值，不作为独立样本处理。配对双尾t检验用于比较斑块和非斑块样本；独立两组比较使用非配对双尾Student's t检验或Welch's t检验。

**结果**
1. 动脉粥样硬化内皮的脂质吞噬功能受损
根据纳入和排除标准，本研究招募了30名接受颈动脉内膜切除术的动脉粥样硬化（AS）患者和30名健康对照组。两组的外周血总胆固醇（TC）和低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）水平均进行了测量。从AS患者中取出的动脉内膜组织被分为斑块区和非斑块区。

**讨论**
动脉粥样硬化仍然是全球心血管发病率和死亡率的主要因素，主要由内皮功能障碍驱动[21]。在本研究中，我们证明了高胆固醇血症通过mTORC1/NPC2信号通路破坏血管内皮细胞的脂质吞噬功能，导致细胞内脂质积累和动脉粥样硬化斑块的加速形成。临床观察到AS患者的TC和LDL-C水平显著升高，进一步证实了这一结论。

**结论**
总之，本研究表明高胆固醇血症与动脉粥样硬化中的内皮脂质吞噬功能受损和脂质积累相关。mTOR信号通路被认为是斑块内皮细胞中的关键通路，雷帕霉素可抑制HCD诱导的mTOR激活和动脉粥样硬化改变。在HAoECs中，mTOR激活减少了NPC2表达，并与p62和PLIN1水平的升高相关。GST pull-down和分子对接支持mTOR和NPC2之间的潜在关联。

**利益冲突声明**
作者声明没有已知的可能影响本文工作的竞争性财务利益或个人关系。

**作者名单**
陈乐高 | 陆伟勤 | 廖龙 | 孙静 | 郑文杰 | 蒙奎 | 庞建良 | Yan Efr?ta Sembiring | 蒋金松