星斑川鲽（Platichthys stellatus）高温应激的血液学参考区间与诊断生物标志物

《Fishes》：Hematological Reference Intervals and Diagnostic Biomarkers for High-Temperature Stress in Starry Flounder (Platichthys stellatus)

　　

种特异性血液学参考区间和可靠的血液生物标志物对于水产养殖中的生理健康评估和疾病诊断至关重要，然而养殖星斑川鲽（Platichthys stellatus）的相关信息仍然缺乏。本研究旨在建立最优养殖条件下养殖星斑川鲽的血液学和血浆生化参考区间，并识别与高温应激相关的诊断生物标志物。研究在低温（4.1–5.7 °C，n = 30）、最适（16–19 °C，n = 62）和高温（26–28 °C，n = 32）条件下，对总共124尾临床健康的亚成体星斑川鲽（平均全长28.9 ± 0.3 cm；平均体重402.2 ± 13.7 g）进行了调查。分析了13项血液学和血浆生化变量，包括渗透压、钙、镁、皮质醇、热休克蛋白70（HSP70）、葡萄糖、总胆固醇、总蛋白、免疫球蛋白M（IgM）、天冬氨酸氨基转移酶（AST）、碱性磷酸酶（ALP）、血红蛋白和红细胞压积。在最适温度下饲养的鱼类按照ASVCP建议建立了参考区间。大多数血液变量在不同温度组之间观察到显著差异（p < 0.05）。血浆皮质醇在区分高温鱼类方面表现出最高的诊断性能（AUC = 0.870），其次是渗透压（AUC = 0.812）。主成分分析显示不同温度组之间存在明显的生理反应差异，而随机森林分析确定皮质醇和渗透压为最具影响力的变量，ALP、总蛋白和AST也对最适温度与高温鱼类之间的区分有贡献。HSP70浓度在高温条件下趋于升高，尽管各温度组之间的差异不具有统计学显著性。这些发现首次为养殖星斑川鲽提供了血液学参考区间，并确定血浆皮质醇为在所检查条件下检测高温应激诊断性能最高的生物标志物。所提出的参考区间和诊断生物标志物为星斑川鲽养殖中的生理健康评估和早期热应激监测提供了实用框架。

**论文解读：星斑川鲽高温应激的血液学参考区间与诊断生物标志物研究**

**研究背景与问题**
气候变化正增加极端温度事件的发生频率和强度，对水产养殖生产构成重大挑战。水温对鱼类尤为重要，因为鱼类作为变温动物，其代谢率、需氧量、生长、渗透调节、免疫功能和内分泌应激反应均与水温密切相关。当水温超过种特异性最适范围时，生理补偿可能不足，导致生长受损、代谢紊乱、抗病力下降乃至死亡。星斑川鲽（*Platichthys stellatus*）是一种具有商业价值的冷温性比目鱼，广泛分布于北太平洋，在韩国被视为潜在的替代养殖品种。然而该物种相对适应冷水环境，夏季高温是制约其养殖的重要因素。以往关于星斑川鲽热应激的研究多集中于比较不同温度处理间的平均生理值差异，但统计学显著差异并不等同于某个变量具有足够的诊断性能来区分个体是否处于热应激状态。因此，建立种特异性血液学参考区间，并筛选具有高灵敏度、高特异性的诊断生物标志物，对于星斑川鲽养殖中的健康管理和早期热应激监测具有重要意义。

**研究内容与意义**
研究人员于2023—2025年每年春季从韩国东海岸一家商业陆基养殖场获取养殖亚成体星斑川鲽，在低（4.1–5.7 °C）、最适（16–19 °C）和高温（26–28 °C）三种条件下进行控制实验，分析了13项血液学和血浆生化变量。研究人员按照ASVCP建议建立了最适温度下养殖星斑川鲽的暂定参考区间，并通过ROC曲线和随机森林分析评估了各变量对高温应激的诊断价值。结果表明，血浆皮质醇和渗透压具有较高的诊断性能，能够有效区分高温应激个体与最适温度个体。该研究首次提供了养殖星斑川鲽的血液学参考区间，确定了皮质醇为检测高温应激的最佳生物标志物，为星斑川鲽养殖中的生理健康评估和早期热应激监测提供了实用框架。该论文发表于《Fishes》。

**主要关键技术方法**
研究人员从韩国东海岸商业陆基养殖场获取亚成体星斑川鲽，运输至国立渔业科学研究所后于16 °C暂养至少两周，随后以1 °C/天的速率调整至目标温度，并在目标温度维持7天后采集尾静脉血液。样本量分别为低温组30尾、最适温度组62尾、高温组32尾。渗透压、红细胞压积和血红蛋白直接测定；血浆生化指标采用自动干化学分析仪测定；皮质醇、IgM和HSP70采用ELISA试剂盒测定。参考区间依据CLSI和ASVCP建议计算，以Bootstrap重抽样（1000次）估算95%置信区间。统计分析采用ANOVA或Kruskal–Wallis检验，并结合主成分分析、ROC曲线和随机森林模型评估诊断性能。

**研究结果**
**血液学参考区间**
研究以62尾最适温度（16–19 °C）下临床健康的星斑川鲽为参考群体，计算了13项血液变量的暂定参考区间（2.5–97.5百分位数）。皮质醇、HSP70、葡萄糖、渗透压、血红蛋白和红细胞压积的参考范围相对较窄，而AST在健康群体内表现出较大的个体变异。

**不同温度条件下血液学和血浆生化变量的变化**
与最适温度组相比，低温组（4.1–5.7 °C）的渗透压、钙、总胆固醇、总蛋白、ALP、血红蛋白和红细胞压积相对升高。高温组（26–28 °C）血浆皮质醇浓度显著升高，HSP70呈非显著性升高趋势；葡萄糖和总胆固醇与最适温度组无显著差异，而总蛋白、血红蛋白和红细胞压积趋于降低。这表明高温暴露与血液学和血浆生化稳态的显著改变相关。

**主成分分析**
主成分分析（PCA）显示前两个主成分解释了44.3%的总方差（PC1=34.3%，PC2=11.9%）。PC1主要负载总蛋白、血红蛋白、钙、总胆固醇、红细胞压积、ALP和渗透压，皮质醇和HSP70位于相反方向。三个温度组在PCA排序空间中部分分离：低温组主要分布于PC1正侧，多数高温个体位于PC1负侧，最适温度组居于中间且与两应激组部分重叠。水温影响了星斑川鲽的整体血液特征。

**血液生物标志物的诊断性能**
通过ROC曲线分析评估单个血液变量区分高温组与最适温度组的能力。血浆皮质醇的AUC为0.870，诊断性能最高；ALP次之（AUC=0.816），随后为渗透压（AUC=0.812）；红细胞压积（AUC=0.731）和钙（AUC=0.709）具有中等区分能力。基于Youden指数，皮质醇的最佳临界值约为51.5，对应的敏感性和特异性均约为81%。

**随机森林识别重要生物标志物**
随机森林分析用于评估多个血液变量联合区分最适温度与高温组的能力。在13个变量中，皮质醇的变量重要性最高，其次为渗透压、ALP、总蛋白和AST。钙、总胆固醇、血红蛋白和IgM对模型性能贡献相对较低。该结果与ROC分析一致，确认内分泌应激（皮质醇）、组织相关酶（AST和ALP）以及渗透调节状态（渗透压）是高温暴露的主要关联因素。

**讨论总结与结论**
讨论部分指出，种特异性参考区间受环境条件、年龄、营养状态、养殖系统和分析方法影响，不能直接跨物种或跨养殖方式套用。血浆皮质醇升高反映了高温激活下丘脑–垂体–肾间轴（HPI轴）的内分泌应激反应，但采血操作也可能有所贡献，因此应视为综合应激状态指标。HSP70虽呈升高趋势但未达显著水平，其作为热应激标志物的价值需进一步研究。渗透压下降和血红蛋白、红细胞压积降低提示高温下渗透调节和氧运输能力受损，而AST升高则反映细胞通透性增加或组织损伤。PCA和随机森林的多元分析表明，高温应激涉及内分泌、渗透调节、代谢和组织损伤等多系统协调变化。该研究存在局限性，包括未设置恢复组和未定量监测生长、摄食及行为等，未来需在多样化商业养殖环境中验证参考区间和生物标志物的适用性。
研究结论部分翻译如下：本研究建立了最适温度条件下养殖星斑川鲽的暂定血液学和血浆生化参考区间，并证明了温度超出最适范围时可诱发明显的生理反应。低温暴露主要与代谢和血液学变量改变相关，而高温暴露则以显著的内分泌和渗透调节紊乱为特征。血浆皮质醇和渗透压表现出较强的区分能力，支持其作为高温应激生物标志物的潜力。相比之下，尽管HSP70预期是细胞热应激的敏感指标，但其升高未达统计学显著水平，其诊断效用需进一步评估。这些发现部分支持研究人员提出的假设，并表明热应激涉及多个生理系统的协调变化，而非血液变量的统一反应。在将这些参考区间和生物标志物常规应用于现场之前，仍需在多样化商业水产养殖条件下进行进一步验证和校准。