ATP8B1突变与成熟对CFTR功能及基因表达的影响

《Livers》：Impact of ATP8B1 Mutation and Maturation on CFTR Functionality and Gene Expression

　　

背景/目的：进行性家族性肝内胆汁淤积1型（Progressive Familial Intrahepatic Cholestasis type 1，PFIC1）是一种罕见的常染色体隐性遗传性肝脏疾病，由ATP8B1基因突变引起，导致胆汁酸分泌缺陷和严重临床结局。该病的一种较轻、间歇性形式——良性复发性肝内胆汁淤积（Benign Recurrent Intrahepatic Cholestasis，BRIC）也与ATP8B1突变相关。PFIC1患者常出现肝外症状。值得注意的是，囊性纤维化（Cystic Fibrosis，CF）患者也会出现肝功能障碍，研究人员此前已证明PFIC1患者中CFTR表达显著降低。方法：在本研究中，研究人员通过比较PFIC1（Byler）和BRIC细胞系与野生型对照的基因表达和蛋白成熟，探讨了ATP8B1与CFTR之间的关系。结果：突变细胞中ATP8B1和CFTR转录本均显著减少，导致蛋白合成降低。研究人员鉴定出不同的ATP8B1异构体：野生型细胞中为140 kDa成熟形式，BRIC细胞中为145 kDa变体，PFIC1细胞中为180 kDa形式。利用靶向N端和C端结构域的抗体，研究人员证明野生型ATP8B1经历顺序成熟——首先在内质网中于Gly308位点，然后在Gly556位点（该区域包含D554N PFIC1突变位点）——产生一种具有转录辅因子特征的74 kDa核肽。该肽包含一个NR盒，两侧为STAT5结合基序和一个潜在的PKA磷酸化位点，提示其与小异二聚体伴侣（Small Heterodimer Partner，SHP）相互作用，并调节法尼醇X受体（FXR）和肝细胞核因子1α（HNF1α）的表达，两者均已知可调节CFTR转录。免疫沉淀实验揭示了ATP8B1与CFTR之间的物理结合，支持ATP8B1在CFTR运输和膜插入中发挥伴侣作用。研究还发现PDZK1与ATP8B1相互作用，可能通过PDZ结构域相互作用稳定顶膜上的CFTR。结论：总的来说，研究结果确定ATP8B1是一种多功能蛋白，不仅确保CFTR的正确运输和膜定位，还应通过核信号通路调节其转录。这些发现为PFIC1与囊性纤维化相关肝病之间的分子联系提供了新见解。

**论文解读文章**
**ATP8B1突变与成熟对CFTR功能及基因表达的影响——论文解读**

进行性家族性肝内胆汁淤积1型（PFIC1）是一种罕见的常染色体隐性遗传肝病，由ATP8B1基因突变引起，导致胆汁酸分泌缺陷和严重临床结局。较轻的间歇性形式良性复发性肝内胆汁淤积（BRIC）也与ATP8B1突变相关。既往研究发现，PFIC1患者中囊性纤维化跨膜传导调节因子（CFTR）表达显著降低，而囊性纤维化（CF）患者也常出现肝功能障碍。为探讨ATP8B1与CFTR之间的内在联系，研究人员利用来自PFIC1（Byler）和BRIC患者的细胞系与野生型对照进行比较，系统分析了基因表达、蛋白成熟、CFTR通道功能及蛋白间相互作用。研究发现ATP8B1不仅通过其翻转酶活性协助CFTR质膜插入，还可能通过核内信号通路调控CFTR基因转录，为PFIC1与CF相关肝病提供了新的分子联系。该研究成果发表在《Livers》。

本研究采用的主要技术方法包括：使用PFIC1患者来源的Byler细胞（G308V纯合突变）和BRIC患者来源的Bric细胞（G1241fs移码突变），以及HT29、Calu3、IB3-1、IB3-1/S9、HTCR、Mz-Cha2等细胞系。关键方法有：RT-PCR检测ATP8B1和CFTR的mRNA表达水平；Western blot使用靶向N端（Ac3002）和C端（Ac3001）的抗体检测蛋白分子量及成熟状态；免疫沉淀（IP）验证ATP8B1-CFTR和ATP8B1-PDZK1相互作用；碘外流实验评估CFTR通道功能；免疫组织化学和免疫荧光定位蛋白分布；核蛋白提取与生物信息学分析（TMPred、ELM、STRING等）预测结构域和相互作用网络。

研究结果分述如下：
3.1 ATP8B1和CFTR mRNA合成：通过RT-PCR比较Calu3、HT29、Bric和Byler细胞，发现与Calu3相比，Byler细胞中CFTR和ATP8B1 mRNA分别显著降低70%和75%，Bric细胞中分别降低58%和35%，说明功能性ATP8B1对这两个基因的正常表达至关重要。
3.2 Western blot检测ATP8B1和CFTR蛋白：使用Ac3001抗体在HT29和Calu3中检测到140 kDa成熟ATP8B1，在Bric细胞中检测到145 kDa变体，在Byler细胞中检测到180 kDa变体。CFTR蛋白在Byler细胞中显著减少。在无功能CFTR的IB3-1细胞中ATP8B1几乎不可检测，而在补充野生型CFTR的S9细胞中ATP8B1恢复表达，提示两种蛋白存在相互依赖。
3.3 在表达CFTR的组织中检测ATP8B1：对肺组织切片进行免疫组化染色，发现肺泡上皮细胞和杯状细胞顶端膜存在强烈ATP8B1信号，而对照血清无染色，表明ATP8B1与CFTR在相关组织中共定位。
3.4 Calu3细胞ATP8B1免疫荧光分析：免疫荧光显示ATP8B1定位于内质网、质膜以及细胞核中央区域，其分布与CFTR一致。
3.5 碘外流实验：3.5.1 野生型细胞（Calu3、HT29）在forskolin刺激后出现短暂碘外流峰，可被CFTR特异性抑制剂inh-172消除，证实该外流由CFTR介导。3.5.2 Bric细胞在持续forskolin存在时CFTR开放数分钟，单次刺激后关闭延迟，提示突变的ATP8B1影响CFTR膜整合。3.5.3 Byler细胞在forskolin刺激下无碘外流，转染野生型ATP8B1后CFTR功能恢复，约为HT29水平的70%；低温（27°C）培养也能恢复部分功能，表明无功能ATP8B1时CFTR滞留于内质网。
3.6 ATP8B1与CFTR相互作用：用抗ATP8B1抗体进行免疫沉淀，可在Calu3、Bric和Byler细胞中共同沉淀出CFTR，证明两者存在物理结合。抗PDZK1抗体也能共沉淀ATP8B1，且S9细胞中检测到74 kDa片段，提示ATP8B1、CFTR和PDZK1可能形成复合物。
3.7 ATP8B1成熟：使用Ac3001和Ac3002抗体检测发现，HT29、Bric、S9、MzA2细胞中只有C端抗体阳性，而Byler细胞中N端和C端抗体均阳性，说明野生型ATP8B1在成熟过程中需在Gly308处发生剪切。核蛋白提取物中仅检测到74 kDa C端肽段，推测存在第二次剪切（可能在Gly556），产生具有核受体结合特征的片段。

讨论部分指出，ATP8B1作为伴侣蛋白参与CFTR从内质网到高尔基体再到质膜的转运，其翻转酶活性通过重塑膜磷脂为CFTR插入提供合适微环境。ATP8B1的C端片段可能通过NRBox与小异二聚体伴侣（SHP）相互作用，调节FXR和HNF1α的表达，进而影响CFTR和胆汁盐输出泵（BSEP）等基因的转录。此外，N-肉豆蔻酰化和S-棕榈酰化可能参与该核转位过程。

研究结论：本研究的发现阐明了ATP8B1在细胞内的复杂功能，表明ATP8B1参与CFTR的功能调控。这些结果扩展了先前关于ATP8B1突变或失活影响多个基因表达的研究。使用来自PFIC1患者的细胞强调了功能性ATP8B1蛋白对于CFTR基因正确表达和蛋白正确插入质膜的必要性。当ATP8B1无功能时，CFTR被阻滞在内质网。ATP8B1似乎还充当CFTR的伴侣蛋白，帮助其通过高尔基体到达质膜。尽管研究人员在核蛋白中鉴定到ATP8B1的C端片段，并在同一区域发现与转录调节因子相互作用的特定氨基酸序列，但仍需进一步实验证实。然而，ATP8B1和CFTR的联合免疫沉淀清楚证明了两蛋白之间的相互作用，这可能解释了为何在CFTR突变的细胞中难以检测ATP8B1，并部分解释了CF患者出现的肝胆症状。