首次设计的成纤维细胞生长因子受体4 PROTAC降解剂的设计、合成及其生物活性评估

《Bioorganic Chemistry》：Design, synthesis, and biological evaluation of the first fibroblast growth factor receptor 4 PROTAC degrader

　　

摘要

FGFR4信号通路的异常激活通常由FGFR4基因突变引起，这与肝细胞癌（HCC）的进展有关，这使得FGFR4成为针对FGFR4驱动的HCC的一个有前景的治疗靶点。尽管已经发现了许多选择性的FGFR4共价抑制剂，但开发FGFR4 PROTACs（蛋白酶体介导的共价激活剂）可以作为一种替代和互补的HCC治疗策略，具有很大的优势。在这项研究中，我们通过将FGFR4选择性抑制剂H3B-6527与不同的连接剂结合到E3泛素连接酶上来设计了一系列共价降解剂。其中，我们确定了化合物V1是第一个能够降解FGFR4的PROTAC，其DC??值为0.84 μM，最大降解率达到80%。进一步评估表明，V1通过依赖于泛素-蛋白酶体系统（UPS）的途径有效且持续地降解FGFR4，并且对JHH-7细胞的增殖表现出中等的抑制作用。此外，还通过LC-MS/MS技术表征了V1与FGFR4的共价结合模式。这些发现表明V1是开发FGFR4靶向PROTACs的一个有前景的先导化合物。

引言

成纤维细胞生长因子受体4（FGFR4）属于成纤维细胞生长因子受体（FGFR）亚家族，它在多种生理过程中起着关键作用，包括胚胎和出生后的发育、代谢稳态以及组织维持[1]。然而，由于FGFR4基因突变（如扩增、点突变和基因融合）导致的FGF19/FGFR4信号通路的异常激活与多种肿瘤类型的进展有关，包括乳腺癌[2]、[3]、肝癌[4]、[5]、肺癌[6]和结直肠癌[8]。因此，靶向FGFR4已成为治疗依赖于FGFR4的癌症的一种有前景的方法[9]、[10]。

自2015年首次报道小分子FGFR4选择性抑制剂BLU9931以来[11]，不断有新的FGFR4特异性抑制剂被发现，包括H3B-6527[12]、BLU554[13]和FGF401[14]（图1）。这些抑制剂目前正在或最近完成了临床试验，特别是用于治疗具有异常FGFR4信号的肝细胞癌（HCC）。除了这些正在临床评估的抑制剂外，文献中还继续报道了许多新的FGFR4抑制剂[15]、[16]、[17]、[18]、[19]、[20]。尽管在FGFR4抑制剂的发展方面取得了显著进展，但这些疗法仍然面临与不良反应或获得性耐药性相关的挑战，这也是其他酪氨酸激酶抑制剂常见的现象[21]、[22]、[23]。

除了传统的 pequeno-molécula inhibitors（小分子抑制剂）外，靶向蛋白水解的chimeras（PROTACs）已成为药物发现领域中一种有前景的互补治疗策略[24]、[25]、[26]。这些双功能分子可以同时与目标蛋白（POI）和E3连接酶结合，形成一个三元复合物，使E3连接酶能够在其近端赖氨酸残基上标记泛素，从而通过泛素-蛋白酶体系统（UPS）最终降解目标蛋白[27]、[28]、[29]、[30]。与传统的小分子抑制剂相比，PROTAC技术提供了许多优势，例如提高的目标选择性以及潜在的针对难成药蛋白的能力[31]、[32]、[33]，这可以增强抗肿瘤功效、克服药物耐药性并解决安全性问题。在过去几十年中，许多PROTACs已经证明了其在降解多种目标蛋白（例如AR、ER、BTK）方面的有效性，并已进入临床试验阶段，显示出其显著的治疗潜力[34]。

最近，为了解决传统FGFR小分子抑制剂的局限性，开发了几种能够诱导FGFR亚家族蛋白降解的新PROTACs，包括DGY-09192、LC-MB12、N5和LC-MF-4（图2）。这些降解剂是通过将泛FGFR抑制剂（BGJ398或Erdafitinib）与von Hippel-Lindau（VHL）E3连接酶结合剂或cereblon（CRBN）结合剂连接而构建的。所得化合物有效地诱导了FGFR蛋白的降解，从而实现了FGFR信号的持续抑制，并表现出强大的抗增殖活性[35]、[36]、[37]、[38]。这些发现突显了FGFR-PROTACs的巨大潜力。受到基于FGFR降解策略的优势以及我们在开发FGFR4抑制剂方面的经验的启发[16]，我们报告了一系列共价FGFR4降解剂的设计和合成方法，这些降解剂是通过将FGFR4抑制剂H3B-6527与不同的连接剂连接到E3泛素连接酶上获得的。经过系统的结构-活性关系（SAR）分析，我们确定了化合物V1作为第一个FGFR4的PROTAC降解剂，为未来开发降解FGFR4的靶向治疗剂奠定了基础。

章节片段

FGFR4 PROTAC降解剂的设计

H3B-6527是一种口服可吸收的、高选择性的FGFR4共价抑制剂，其IC??值为1.2 nM。它对FGFR1–3的选择性超过250倍，相应的IC??值分别为320 nM、1290 nM和1060 nM[12]。H3B-6527对HCC细胞表现出强大的抗癌活性，并已成功完成了一期临床试验。鉴于这些有前景的特性，选择H3B-6527作为FOI（目标蛋白）来开发FGFR4特异性PROTAC。

结论

自从Crews等人在2001年引入PROTAC技术以来，人们已经投入了大量努力将已有的抑制剂转化为下一代治疗和研究应用的降解剂。尽管已经发现了一些新的FGFR4抑制剂，但小分子抑制剂的固有局限性仍然存在。在这项研究中，我们设计了一系列针对FGFR4的PROTAC分子，并确定了一个代表性化合物V1。

化学方法

所有试剂和溶剂均从化学供应商处购买，无需进一步纯化即可使用。所有反应进程都通过TLC（硅胶GF254）在紫外光（254或365 nm）或其他染色条件下进行监测。¹H NMR（400或600 MHz）和¹³C NMR（151 MHz）光谱是在DMSO-d?溶液中记录的，使用Bruker光谱仪和四甲基硅烷（TMS）作为内标。偶联常数（J）和化学位移（δ）以Hz和ppm表示。

CRediT作者贡献声明

Yuehui Li：撰写 – 原稿编写、验证、方法学、正式分析。Yu Du：方法学、正式分析、数据管理。Ping Deng：正式分析。Yi Yang：方法学。Yue Wu：数据管理。Xiaomeng Sun：方法学。Qiuzhu Chen：方法学。Juntong Yang：方法学。Qihua Zhu：撰写 – 审稿与编辑、研究。Zongjie Gan：撰写 – 审稿与编辑、研究、资金筹集、概念构思。Rui Long：撰写 – 审稿与编辑、监督、项目管理。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能影响本文工作的竞争性财务利益或个人关系。

致谢

本工作得到了中国重庆市自然科学基金（项目编号CSTB2023NSCQ-MSX0234和CSTB2024NSCQ-MSX0157）以及重庆医科大学未来医学青年创新计划（W0152）的支持。

Yuehui Li|Yu Du|Ping Deng|Yi Yang|Yue Wu|Xiaomeng Sun|Qiuzhu Chen|Juntong Yang|Qihua Zhu|Zongjie Gan|Rui Long重庆医科大学第一附属医院药学系，中国重庆400016