《Biosensors and Bioelectronics》：Ultrasensitive Real-Time Detection of SARS-CoV-2 Proteins with Arrays of Biofunctionalized Graphene Field-Effect Transistors
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摘要：随着石墨烯场效应晶体管（GFET）在生物传感应用中日益受到关注，对于实现灵活且多重生物功能化的策略，以及与微流控集成的高度并行化、实时电子读出的需求十分迫切。本文提出了一种应对这些挑战的方法，该方法能够在自动化的电子与微流控平台内，对集成于单个微加工芯片
摘要：随着石墨烯场效应晶体管（GFET）在生物传感应用中日益受到关注，对于实现灵活且多重生物功能化的策略，以及与微流控集成的高度并行化、实时电子读出的需求十分迫切。本文提出了一种应对这些挑战的方法，该方法能够在自动化的电子与微流控平台内，对集成于单个微加工芯片上的多个GFET进行实时、并行的监测。研究人员通过超灵敏检测SARS-CoV-2刺突（S）蛋白和核衣壳（N）蛋白，展示了该方法的能力。GFET芯片通过范德华（van der Waals, vdW）组装方式，利用厚度为1 nm的分子二维（2D）材料——碳纳米膜（CNMs）——实现功能化，该方法可实现多重生物功能化。芯片被集成到一个定制开发的微电子和微流控系统中，该系统可对15个GFET进行并行、实时、自动化的测量。研究人员展示了GFET与抗体的原位生物功能化，随后对S蛋白和N蛋白进行选择性检测，实验检测到的最低浓度分别为10 aM（S蛋白）和100 aM（N蛋白），动态范围跨越四个数量级。由于其通用性，所提出的平台可方便地适用于检测各种生物和化学靶标。
**论文解读：基于生物功能化碳纳米膜/石墨烯场效应晶体管阵列的超灵敏实时SARS-CoV-2蛋白检测**
**1. 研究背景与问题**
冠状病毒SARS-CoV-2的爆发凸显了早期、准确检测病毒对于防止全球健康危机升级的关键意义。尽管逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）等既有检测方法具有准确性和高灵敏度，但其操作复杂且依赖专门实验室条件，使其不适用于即时检测（PoC）应用以及连续、实时的生物传感。为克服这些缺陷，研究转向开发便携式单芯片生物传感器。二维（2D）纳米材料特别是石墨烯基场效应晶体管（GFET）的发展，为病毒检测开辟了新途径，可实现更快、更灵敏且兼容PoC的诊断方案。GFET以其优异的电子性能、高灵敏度和生物相容性著称，能够在不进行复杂样品制备或扩增的情况下直接检测生物分子。
尽管可扩展的多路GFET阵列正推动高通量筛选的进步，但其底层电子架构限制了数据保真度和时间分辨率。现有系统多采用时分复用方式，这是一种顺序过程，导致阵列总测量时间直接随传感器数量增加而延长，并在信号通道与参考通道之间引入不期望的时间偏移。此外，GFET与其它纳米材料的集成虽能增强性能，但将生物识别元件功能化到原始石墨烯表面面临重大挑战：石墨烯的化学惰性使得共价修饰方法可能破坏其电子性能，而非共价方法虽能保留性能却可能因结合力较弱而稳定性不足。同时，生理离子强度条件下的目标生物分子电荷屏蔽效应是GFET生物传感器应用的又一难题。为缓解电荷屏蔽，常采用降低缓冲液离子强度以增大德拜长度（λD）的策略，但这可能影响生物分子结构与结合活性，并因稀释而降低分析物浓度。因此，有策略提出在生理离子强度缓冲液中进行结合反应，随后置换为稀释缓冲液进行电学测量，以扩展德拜长度并提高传感器灵敏度。该方法的可靠实施需要可控的缓冲液置换和精确的电学特性记录，而自动化微流控系统有助于减少人为误差并降低误读生物传感器性能的风险。基于上述背景，本研究旨在解决GFET阵列生物传感器中生物功能化的稳定性、生理条件下的电荷屏蔽效应以及平行实时数据采集的需求。
**2. 研究内容与意义**
研究人员引入了一种检测策略，以实现超灵敏、实时的SARS-CoV-2蛋白检测。该策略通过范德华（vdW）组装方式，使用氮端基修饰的碳纳米膜（N3-CNM）对GFET进行功能化，在不影响石墨烯电子性能的前提下实现抗体的共价固定。研究团队构建了一套专用的测量电子设备和自动化微流控系统，能够对芯片上的15个GFET进行并行、实时、自动化的测量。该平台实现了对SARS-CoV-2刺突（S）蛋白和核衣壳（N）蛋白的超灵敏检测，最低检测浓度分别达到10 aM和100 aM，动态范围跨越四个数量级，并展示了在一个GFET芯片上同时选择性检测这两种蛋白的能力。该平台的通用性使其可便捷地适用于检测广泛的生物和化学靶标，为下一代生物传感器的开发提供了重要技术基础。论文发表在《Biosensors and Bioelectronics》。
**3. 主要关键技术方法**
本研究涉及多项关键技术与方法。首先，采用电子束光刻（EBL）和干法刻蚀等微加工工艺批量制备石墨烯场效应晶体管（GFET）芯片。其次，利用低能电子辐照和化学修饰方法合成叠氮端基的碳纳米膜（N3-CNM），并通过湿化学刻蚀转移法与石墨烯组装形成范德华（vdW）异质结，实现GFET表面的稳定功能化。再次，采用点击化学将二苯并环辛炔（DBCO）标记的抗体固定在N3-CNM/GrFET表面，实现抗体的位点特异性共价偶联。此外，构建了包含31个通道的源测量单元（SMU）和集成微流控系统，实现对15个GFET的并行实时电学测量与可控液体注入，并利用参考器件进行差分信号分析。
**4. 研究结果**
**4.1 生物功能化GFETs及其与读出电子学和微流控的集成**
研究人员通过vdW异质结构组装将叠氮功能化的N3-CNM作为超薄二维分子中介层，利用点击化学将DBCO标记的SARS-CoV-2 IgG抗体固定于GFET表面。芯片由15个独立的GFET器件组成，集成于含Ag/AgCl参比电极的微流控通道内。与传统的时分复用系统不同，本系统的核心特征在于为每个器件配备独立的源测量单元（SMU）。该并行读出架构能够同步获取所有器件的转移曲线，确保信号与参考通道之间无时间偏移，从而消除由时间漂移、缓冲液置换瞬态和栅极扫描历史差异引起的伪响应。
**4.2 实时监测抗体的固定化**
通过实时监测SARS-CoV-2 S蛋白抗体（Ab(S)）在N3-CNM/GFET表面的固定过程，研究人员验证了平台的动力学分析能力。实验中，部分器件固定了与Ab(S)大小和重量相近的C反应蛋白抗体（Ab(Ref)）作为参考。在注入Ab(S)溶液后，由于缓冲液置换效应，所有器件均出现显著的电中性点（VCNP）负向漂移；当重新引入测量缓冲液后，信号器件与参考器件之间出现逐渐增加的差分响应，最终在65分钟后达到约-25.8 mV的稳定相对位移，此信号归因于Ab(S)在信号器件上的特异性结合。该结果表明平台能够实时监测抗体结合动力学。
**4.3 实时抗原检测**
研究人员采用分步策略实现高灵敏度抗原检测：首先在生理离子强度缓冲液（1X PBS-P）中进行抗原结合以保持生物分子活性并实现特异性识别，随后置换为稀释缓冲液（0.0003X PBS-P）进行电学测量，以增大德拜长度（λD）、减弱电荷屏蔽效应。在S蛋白检测实验中，当注入1 pM S蛋白后，在稀释缓冲液中观察到差分传感图的负向漂移，表明信号器件发生了电子掺杂，这与S蛋白带正电的特性一致。随后通过甘氨酸-盐酸溶液能够有效实现传感器表面再生，并且该过程至少可重复五个周期。利用同步采集的信号与参考器件差分分析，能够有效地消除离子强度变化和基线漂移的影响，证实了在低离子强度缓冲液中进行可靠测量的可行性。
**4.4 S蛋白和N蛋白的浓度系列检测**
通过连续注入不同浓度的抗原溶液，研究人员系统评估了传感器的检测动态范围。对于S蛋白，当浓度低至10 aM时即可在差分传感图中分辨出明确的下移响应，其响应值为-20.6±4.4 mV，对应基线波动的4.1倍。随着浓度从100 aM增加至100 fM，响应逐渐增大，呈现出明显的浓度依赖性。当浓度超过1 pM后响应趋于饱和，表明表面结合位点已被占据。因此，S蛋白检测的动态范围为约四个数量级（~10 aM至~100 fM）。对于N蛋白，首次可检测到的响应出现在100 aM浓度，响应为-8.7±2.9 mV，对应基线波动的1.5倍，而动态范围约为2-3个数量级（~100 aM至~100 fM）。上述结果证明了传感器对两种SARS-CoV-2蛋白均具有极高的灵敏度。
**4.5 传感器响应的模型分析**
为定量分析传感器响应，研究人员建立了一个分析模型，将GFET/电解质界面描述为石墨烯通道、CNM/抗体层和双电层三个电容耦合层组成的系统，通过电荷中性条件求解。模型明确考虑了测量方案中的两种离子强度条件，并采用Langmuir-Freundlich吸附等温线描述结合事件引起的表面电荷变化，同时考虑了抗体自身电荷。利用表面等离子体共振（SPR）测得的平衡解离常数（KD）作为输入，模型拟合结果与实验数据吻合良好。模型提取的抗体负电荷密度与IgG抗体在pH 7.4时的典型负电性一致；提取的S蛋白和N蛋白正电荷密度与文献报道值相符。模型分析还揭示了高灵敏度产生的原因：一是表面电势静电增强目标蛋白在传感器表面的吸附；二是稀释缓冲液中电荷屏蔽效应的减弱使GFET高效地将局部表面电荷变化转换为强电学信号。基于该模型，计算得到S蛋白的理论检出限（LoD）为5 aM，N蛋白为95 aM（1σ判据）。
**4.6 多功能集成：单芯片上S蛋白和N蛋白的选择性检测**
利用多器件的GFET架构和并行的器件级读出能力，研究人员展示了在一个芯片上同时选择性检测S和N蛋白的能力。将同一芯片上的不同器件分别功能化Ab(S)、Ab(N)和Ab(Ref)后，依次注入1 pM S蛋白和1 pM N蛋白。差分传感图显示，固定Ab(S)的器件仅对S蛋白产生显著的下移响应（24.3 mV），对N蛋白的交叉响应仅为3.8 mV，低于基线波动，不构成可分辨的响应；固定Ab(N)的器件则仅对N蛋白产生31.7 mV的响应，对S蛋白交叉响应为2.1 mV。对应的选择性比率分别为11.6和8.3。此外，研究人员还构建了一个集成化的便携式传感平台，通过概念验证实验成功检测到1 pM N蛋白，结果与实验室系统一致，展示了该技术走向未来即时检测应用的潜力。
**5. 讨论与结论**
综上所述，研究人员开发了一种基于CNM-GFET异质结构的可扩展传感方法，实现了对生物标志物的实时、超灵敏检测，并以SARS-CoV-2蛋白检测作为研究案例。该平台能够在碳纳米膜上实现识别元件（如抗体）的位点特异性共价固定，同时保持底层石墨烯固有的电子性能。自动化微流控系统与并行电学读出的集成，允许对单芯片上的多个GFET进行具有高时间分辨率和保真度的同步监测，为稳健的动力学和统计分析提供了可能。内置参考通道用于补偿体效应、基线漂移和非特异性信号，实现了可靠的差分传感图分析。通过定量分析两种不同缓冲液之间的信号变化，研究人员估算了抗体和靶标的电荷密度，并利用解析模型计算了特异性结合响应。传感器成功检测到浓度低至10 aM的S蛋白和100 aM的N蛋白，模型推导的检出限分别为5 aM和95 aM，且交叉响应均低于差分传感图的基线波动。基于所开发的生物功能化策略和电学读出方法，研究人员进一步展示了概念验证的便携式传感装置，为未来即时检测应用迈出了重要一步。
