《Bioresource Technology》：Programming 2,3-butanediol biosynthesis in
Saccharomyces cerevisiae with AI-optimized dual-optogenetic switches
编辑推荐：
•双重光遗传开关将酵母生长与产物合成解耦。•机器学习优化了超越经验策略的动态光照方案。•模型指导的光照使2,3-丁二醇的产量提高了15.6%。•光子通量归一化实现了在5升光生物反应器中的放大。引言在可持续生物制造日益增长的需求驱动下，精确调控代谢以最大化生物合成效率仍然是代谢
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双重光遗传开关将酵母生长与产物合成解耦。
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机器学习优化了超越经验策略的动态光照方案。
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模型指导的光照使2,3-丁二醇的产量提高了15.6%。
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光子通量归一化实现了在5升光生物反应器中的放大。
引言
在可持续生物制造日益增长的需求驱动下，精确调控代谢以最大化生物合成效率仍然是代谢工程面临的一大挑战（Ko等，2020；Lalwani等，2018）。包括基因过表达和基因敲除在内的静态策略往往缺乏时空分辨率，无法平衡细胞生长与产物合成（Cui等，2019；Deng等，2024；Holtz和Keasling，2010）。动态调控则可根据细胞内代谢状态和细胞外条件作出适应性反应，实时调节代谢通量，以平衡碳源在生物量积累和产物合成之间的分配（Deng等，2024；Zhang等，2012）。目前的策略主要依赖于合成生物开关，包括半乳糖诱导的Cre-lox系统（Lapique和Benenson，2014）、工程化的RNA聚合酶-转录因子相互作用（Soma等，2014）、CRISPR干扰（Cress等，2015；Gordon等，2016）以及群体感应电路（Cress等，2015；Ge等，2022）。然而，这些系统通常依赖于化学诱导剂或内源性信号分子，受响应延迟（Khalil和Collins，2010；Toettcher等，2011）和宿主代谢串扰（Cardinale和Arkin，2012）的限制，从而制约了发酵过程中代谢通路的实时调控。
光具有无毒、可逆和非侵入性的特点，使其成为实时代谢调控的理想诱导剂（Toettcher等，2011）。光遗传学方法已应用于酵母代谢工程，通过可编程的光输入实现了基因表达、代谢通量分配和生产表型的动态控制（Bezold等，2023；Liu等，2025；Zhao等，2021；Zhao等，2020）。特别是，Zhao等在酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）中开发了蓝光响应的OptoEXP和OptoINVRT系统，实现了生长阶段和生产阶段的动态切换，并提高了高级醇的产量（Zhao等，2018）。后续工具，包括光控CRISPRi模块（Wu等，2020）、光学操纵子（如OptoLacI）（Liu等，2024）和双功能开关（Liu等，2024；Reshetnikov等，2022），已展示了光介导的通量分配和替代化学诱导的能力。然而，这些工具大多在转录水平发挥作用。DNA转录和mRNA翻译的延迟导致激活滞后，而预合成的酶在光照关闭后仍然存在，导致"关闭"动力学缓慢（Olson等，2014）。因此，转录开关通常缺乏精确实时控制所需的时域分辨率。通过直接翻译后调控酶稳定性可以绕过这些瓶颈，减少激活和失活延迟（Chen等，2025；Olson和Tabor，2012；Zhou和Deiters，2021）。光敏退化标签（psd）可在光照下迅速降解目标蛋白（Renicke等，2013），而光诱导稳定标签（SULI）将光依赖性稳定与末端兼容性相结合，实现了高时域分辨率的调控（Mao等，2023）。
尽管取得了这些进展，光驱动的生物制造仍受限于工艺控制和光生物反应器的限制（Grimm等，2025）。由于细胞响应对外部光信号呈非线性耦合，包括光强度和脉冲频率在内的经验参数优化不足以确定合适的控制方案（Espinel-Ríos等，2024；Olson等，2014）。此外，由于缺乏对光-代谢相互作用的机理认识，且可迁移的工艺模型匮乏，亟需一种系统且可预测的光遗传工艺优化框架。近年来，机器学习（ML）作为一种解析复杂生物动力学的新方法崭露头角。通过识别代谢状态与生物合成效率之间的非线性关联，机器学习可以支持生物系统的建模和动态控制（Camacho等，2018）。Del Rio-Chanona等利用神经网络优化了补料分批发酵，将角黄素产量提高了40%以上，展示了机器学习导航复杂细胞响应景观的能力（Del Rio-Chanona等，2019）。
2,3-丁二醇（2,3-BDO）是一种用途广泛的可再生平台化学品，用于液体燃料、高分子材料和制药领域（Xu等，2014；Yatabe等，2023）。虽然克雷伯氏菌（Klebsiella）等天然高产菌株具有较强的生物合成能力，但其致病性限制了工业应用（Kim等，2013；Xu等，2014）。相比之下，酿酒酵母（S. cerevisiae）被公认为安全（GRAS），遗传操作方便，适合大规模生物制造（Hong和Nielsen，2012）。然而，其原生2,3-BDO合成能力极弱，需要进行大量的代谢工程改造，包括引入异源通路（Lee和Seo，2019）、减少竞争性副产物（Kim等，2016；Lee等，2023）以及恢复氧化还原辅因子平衡（Kim等，2016；Lee等，2023）。尽管取得了这些进展，来自原生乙醇发酵通路的碳通量竞争仍然是限制2,3-BDO生物合成效率的主要瓶颈（Lee等，2023）。
本研究以酿酒酵母（S. cerevisiae）中的2,3-BDO生物合成为对象，开发了一种整合策略，将基于蛋白稳定性的光遗传调控与机器学习指导的光照优化相结合。采用SULI和psd的双模系统分别对2,3-BDO生物合成通路和竞争性乙醇通路进行协调调控，同时引入异源NADH氧化酶表达以支持辅因子再生。将"时序光照-产量"卷积神经网络（CNN）与差分进化（DE）算法相结合，确定了可实施的优化光照方案以提高产量。此外，在5升光生物反应器中评估了该工程系统的可迁移性，提供了一套系统整合光遗传学、机器学习和生物工艺优化的框架。
章节摘要
实验菌株
酿酒酵母（S. cerevisiae）BY4742（来源于S288C；MATα his3Δ1 leu2Δ0 lys2Δ0 ura3Δ0）用作亲本菌株。除携带异源质粒的菌株外，所有菌株均通过同源重组构建，即通过PCR扩增的DNA片段整合到染色体中，实现psd/SULI标签的插入和PDC5/PDC6的敲除。工程菌株的完整列表、基因型及相应的异源质粒见补充数据。大肠杆菌Escherichia coli DH5α用于
单个光遗传模块提高酿酒酵母中2,3-BDO的生物合成
酿酒酵母（S. cerevisiae）BY4742用作亲本菌株。在工程改造之前，评估了其原生2,3-BDO生产能力。72小时发酵期间仅检测到微量的2,3-BDO和痕量的双乙酰（见补充材料），这与酵母原生2,3-BDO通路活性较低的结果一致（Kim等，2017）。为了增加从丙酮酸流向2,3-BDO前体的碳通量，引入了一条由alsS（双乙酰丙酸合酶）和
结论
本研究开发了一种基于蛋白稳定性的光遗传策略，动态协调酿酒酵母（S. cerevisiae）中的细胞生长与2,3-BDO生产。对PDC1和BDH1的互补调控将碳通量从乙醇生成重新定向至2,3-BDO生物合成。代谢通量分析表明，乙醇生成的抑制施加了额外的氧化还原约束，而这一约束通过异源NADH氧化酶表达得到了部分缓解。对诱导时机的经验优化，
伦理批准与参与同意
不适用。本研究不涉及人类参与者、人类数据、人类组织或动物。
CRediT作者贡献声明
杨赛南（Yang Sainan）：撰写——审阅与编辑、撰写——初稿、验证、软件、数据管理。刘仁美（Liu Renmei）：撰写——审阅与编辑、指导、方法论。欧德崇（Ou Dechong）：方法论、调查、数据管理。杨澄涵（Yang Chenghan）：撰写——审阅与编辑、方法论、形式分析。陈一玥（Chen Yiyue）：撰写——审阅与编辑、可视化。陈佳元（Chen Jiayuan）：撰写——审阅与编辑、调查。岳琦（Yue Qi）：撰写——审阅与编辑。陈贤军（Chen Xianjun）：验证、资源，
利益冲突声明
作者声明不存在任何已知的竞争性经济利益或个人关系，这些利益或关系可能影响本文所报告的工作。
致谢
本研究得到了国家重点研发计划（资助号：2022YFC3400100）、国家自然科学基金（NSFC；资助号：32121005）、山东省泰山学者计划（编号：tsqn202312316）、上海市基础研究试点计划（编号：22TQ1400100-14）、上海市自然科学基金（编号：23ZR1416500）和物质生物与动态化学前沿科学中心（编号：JKV01251708）的经费支持。
杨赛南|刘仁美|欧德崇|杨澄涵|陈一玥|陈佳元|岳琦|陈贤军|居储|庄英萍|易扬|田西威
