复发性紫杉醇诱导的外周神经病变大鼠模型中T细胞依赖性疼痛行为调节

《Brain, Behavior, & Immunity - Health》：T Cell–Dependent Modulation of Pain Behaviors in a Rat Model of Recurring Paclitaxel-Induced Peripheral Neuropathy

　　

反复紫杉醇（paclitaxel, PTX）暴露产生不同的短暂性和持续性疼痛表型。T细胞塑造冷痛行为，但不影响机械性异常性疼痛的消退。在第二个PTX周期后，背根神经节（dorsal root ganglia, DRG）和坐骨神经中的T细胞频率升高。反复PTX暴露诱导组织特异性的巨噬细胞、B细胞和自然杀伤（natural killer, NK）细胞重塑。反复PTX暴露改变坐骨神经中的免疫-胶质信号传导。

**复发性紫杉醇诱导外周神经病变的神经免疫机制：T细胞依赖性疼痛表型与组织特异性免疫重塑**

**一、研究背景与科学问题**

过去二十年间，癌症治疗取得显著进展，患者生存期明显延长，但化疗诱导的外周神经病变（chemotherapy-induced peripheral neuropathy, CIPN）作为常见的剂量限制性毒性反应，严重影响患者生活质量。CIPN以冷痛和机械性异常性疼痛（allodynia）、自发痛及情感障碍为特征，部分症状在停药后可持续数月甚至更久，但目前缺乏有效的防治策略。紫杉醇（paclitaxel, PTX）是治疗非小细胞肺癌、乳腺癌、胰腺癌等多种实体瘤的一线化疗药物，临床中约60%至70%的患者接受PTX治疗后出现神经病变症状。PTX的神经毒性机制涉及微管破坏、轴突变性、胶质细胞活化及神经炎症，其中背根神经节（dorsal root ganglia, DRG）和外周神经中T细胞、B细胞、巨噬细胞等免疫细胞的浸润和激活被认为在疼痛发生和维持中发挥关键作用。

临床实践中，PTX通常以周期性方案给药，肿瘤复发后往往需要再次化疗，导致累积神经毒性暴露增加。然而，大多数临床前模型采用连续数天注射的压缩给药方案，缺乏临床实际的停药间歇和再暴露过程，且多数研究仅关注单周期治疗，对复发性或反复性PTX诱导的外周神经病变（paclitaxel-induced peripheral neuropathy, PIPN）的生物学机制和疼痛表型特征认识不足。此外，以往研究多使用同时缺失T细胞和B细胞的免疫缺陷小鼠模型，难以在完整的神经免疫环境中解析特定淋巴细胞亚群的独立贡献。因此，阐明反复PTX暴露下外周感觉神经元与T细胞等免疫细胞之间的相互作用，对于发展机制导向的疼痛治疗策略至关重要。

**二、研究内容与结论**

研究人员以T细胞功能缺陷的纯合RNU^-/-大鼠及其T细胞功能完整的杂合RNU^+/-同窝对照为对象，建立两个周期PTX治疗（2 mg/kg，腹腔注射，隔日一次，每周期4次）的复发性PIPN模型，纵向监测机械性异常性疼痛、冷痛觉过敏（hyperalgesia）、冷异常性疼痛及焦虑相关探索行为，并在第4周和第14周收集DRG、坐骨神经和脾脏，通过流式细胞术、免疫组织化学和实时荧光定量PCR分析免疫细胞组成、巨噬细胞极化状态及胶质细胞活化特征，系统揭示了T细胞在反复PTX暴露中对疼痛行为的差异化调节作用。研究发现，机械性异常性疼痛在治疗周期之间可自发消退，且不依赖T细胞；而冷痛觉过敏在T细胞完整大鼠中持续存在，冷异常性疼痛则仅在T细胞完整大鼠中出现，提示T细胞特异性参与冷痛行为的塑造。反复PTX暴露还引起组织特异性的T细胞频率升高、CD4⁺/CD8⁺比值下降、NK细胞和B细胞分布改变，以及巨噬细胞M1/M2极化状态的动态变化，同时伴随DRG卫星胶质细胞增生减少和坐骨神经中iNOS相关信号的T细胞依赖性调节。该研究论文发表在《Brain, Behavior, 》。

**三、主要技术方法**

本研究使用8周龄雄性Rowett裸鼠（Crl: NIH-Foxn1^rnu），包括T细胞缺陷纯合子（RNU^-/-）和T细胞完整杂合子（RNU^+/-），购自Charles River Laboratories（Wilmington, MA, USA）。PTX采用腹腔注射，每周期4次，间隔给药，共两个周期。行为学评估采用von Frey纤维丝测试机械性异常性疼痛、丙酮喷雾法评估冷异常性疼痛、干冰法评估冷痛觉过敏、旷场实验评估焦虑相关探索行为。组织样本在第一次周期后3周（第4周）和第二次周期后3周（第14周）采集，分别进行流式细胞术分析免疫细胞亚群、免疫组织化学检测胶质细胞和巨噬细胞标志物、qPCR检测神经炎症相关基因表达。

**四、研究结果**

**3.1 周期间PTX诱导的机械异常性疼痛消退不依赖T细胞。** 通过von Frey纤维丝测试发现，两个品系大鼠在第一周期PTX后机械阈值均显著下降，随后逐渐恢复，约第9周接近基线水平。第二周期后机械阈值下降幅度小于第一周期，但T细胞状态对整体机械反应影响不大。

**3.2 冷痛觉过敏在T细胞完整大鼠中持续存在且不恢复。** 干冰测试显示，T细胞完整大鼠在第一周期后出现快速且持续至实验结束的冷痛觉过敏，第二周期后无加重；而T细胞缺陷大鼠未出现显著的冷痛觉过敏。

**3.3 冷异常性疼痛仅发生于T细胞完整大鼠。** 丙酮喷雾测试表明，T细胞完整大鼠在两个周期后均出现冷异常性疼痛，且在第一周期后第9周消退；T细胞缺陷大鼠始终未出现显著冷异常性疼痛。

**3.4 T细胞状态影响反复PTX暴露后的焦虑相关探索行为。** 旷场实验显示，第二周期后T细胞缺陷大鼠的中心区探索距离、时间和进入次数均低于T细胞完整大鼠，而总运动距离增加，说明差异并非由整体运动能力下降导致。

**3.5 巨噬细胞群体呈组织特异性和T细胞依赖性变化。** 流式细胞术和免疫组化显示，DRG和坐骨神经中CD163⁺ M2样巨噬细胞频率在两种基因型间无差异，但第二周期后脾脏M2巨噬细胞减少（不依赖T细胞）；坐骨神经中CD68⁺CD206⁺ M2亚群仅在T细胞缺陷大鼠中增加。促炎性CD86⁺ M1样巨噬细胞在T细胞完整大鼠的坐骨神经和脾脏中增加，而DRG中减少，呈现复杂的组织与T细胞依赖性调控。

**3.6 B细胞群体呈现组织特异性和T细胞依赖性差异。** 第二周期后，T细胞缺陷大鼠DRG中B细胞频率降低，T细胞完整大鼠坐骨神经中B细胞频率升高，脾脏中B细胞频率无周期差异但T细胞缺陷大鼠持续更高。

**3.7 NK细胞群体呈组织和T细胞依赖性变化。** 第二周期后，T细胞缺陷大鼠DRG中NK细胞频率增加，两品系坐骨神经中NK细胞均增加，而T细胞完整大鼠脾脏NK细胞减少。成熟NK细胞在DRG中增加不依赖T细胞。

**3.8 T细胞频率和CD4/CD8平衡呈组织特异性变化。** 流式分析显示，第二周期后DRG和坐骨神经中T细胞频率升高、脾脏中降低，同时DRG和坐骨神经中CD4⁺ T细胞减少、CD8⁺ T细胞增加，CD4/CD8比值下降，脾脏中无显著变化。

**3.9 DRG和坐骨神经中iNOS相关细胞呈T细胞依赖性变化。** 免疫组化显示，第二周期后DRG中谷氨酰胺合成酶阳性（GS⁺）卫星胶质细胞减少（不依赖T细胞）；T细胞完整大鼠DRG和坐骨神经中iNOS⁺细胞及iNOS⁺施万细胞减少，而T细胞缺陷大鼠无此变化。

**3.10 坐骨神经转录程序呈T细胞依赖性和非依赖性变化。** qPCR显示，T细胞完整大鼠第二周期后Lcn2和Egr2表达降低，而T细胞缺陷大鼠Ephb2和Mfsd2a表达改变；Il4在T细胞完整大鼠中降低，Il13表达模式发生逆转，Il1β在T细胞缺陷大鼠中持续高表达，提示免疫-施万细胞信号传导的基因特异性重构。

**五、讨论与结论**

本研究揭示了反复PTX暴露下机械和冷模态疼痛表型的差异性调节机制。机械异常性疼痛在两个周期之间可消退且不依赖T细胞，这与以往基于免疫缺陷小鼠模型的研究结果不同，可能归因于物种、性别（本研究使用雄性大鼠）及免疫缺陷范围的差异。相比之下，冷痛行为表现出明确的T细胞依赖性——T细胞完整大鼠出现持续性冷痛觉过敏和周期性冷异常性疼痛，而T细胞缺陷大鼠则未出现显著冷敏感变化。免疫细胞分析显示，反复PTX暴露引起DRG、坐骨神经和脾脏中T细胞、B细胞、NK细胞和巨噬细胞亚群的差异化重塑，且部分变化具有组织和T细胞依赖性。胶质细胞方面，卫星胶质细胞增生在第二周期后减少，而iNOS相关信号和施万细胞相关基因表达呈现T细胞依赖的精细调控。这些发现表明，反复PTX暴露并非激活单一的炎症通路，而是通过动态、组织特异性和细胞类型特异性的神经免疫机制，塑造不同的疼痛表型及其持续性特征。

**研究结论（原文翻译）：** 总之，反复PTX暴露差异性调节PIPN的行为和神经免疫特征。机械异常性疼痛是一种短暂表型，可在治疗周期之间消退，且在第二周期后观察期内机械阈值下降幅度较小。相反，冷敏感性因T细胞状态而异，T细胞完整大鼠表现为持续性冷痛觉过敏和短暂性冷异常性疼痛，而T细胞缺陷大鼠相对基线未达到显著水平。在上述阶段中，PTX暴露与T细胞、NK细胞、巨噬细胞和B细胞等免疫细胞群体的动态、组织特异性变化相关，且不存在统一的炎症激活模式。相反，神经免疫反应从第一周期后的广泛胶质细胞活化转向反复暴露后更具选择性的细胞类型和基因特异性调节，包括T细胞依赖性巨噬细胞群体及活化状态调节、iNOS相关信号传导以及施万细胞和外周神经内转录程序的改变。总体而言，反复PTX暴露参与调节情境依赖的神经免疫机制，这些机制与不同的神经病理性疼痛表型及其持续性相关，而非单一协调的炎症通路。