自适应实验室进化实现Clostridium sp. JS66的碳负型混养发酵并增强链延长

《Bioresource Technology》：Adaptive laboratory evolution enables carbon-negative mixotrophic fermentation and enhanced chain elongation in Clostridium sp. JS66

　　

适应性实验室进化（adaptive laboratory evolution，ALE）增强了Clostridium sp. JS66 对 CO2 的固定能力。进化得到的 ALECO2 菌株对 CO2 的摄取量比野生型高 9.5 倍。H2 辅助的 CO2 再同化使碳通量转向 C6 产物且不排放 CO2。葡萄糖与外源 CO2 共利用使碳摩尔得率（Cmetabolite/Csugar，CM/CS）升至 1.10。ALECO2 建立了一种以葡萄糖为原料进行碳负型 C6 产物生产的平台。

《Bioresource Technology》刊发的该研究以丙酮杆菌属（Clostridium sp.）JS66 为对象，针对常规糖发酵中丙酮酸脱羧导致约三分之一碳以 CO₂ 形式损失、传统异养发酵碳回收上限约 67% 的问题，提出利用产乙酸菌的 Wood-Ljungdahl 途径（WLP，伍德-伦达尔途径）再同化 CO₂ 以提升碳保存。已有合成共培养体系可实现外源 CO₂/H₂ 利用，但种群比例与种间交换带来控制难度；厌氧非光合（ANP，anaerobic non-photosynthetic）混养单菌体系更简单，但模型菌多利用果糖且主要产 C2-C3 产物。研究人员以可产己酸（HA，hexanoic acid）且利用葡萄糖的 JS66 为平台，通过 ALE 在 CO₂/H₂ 条件下筛选获得 ALECO2，旨在把 ANP 混养拓展到葡萄糖基中链羧酸生产，实现 CO₂ 再同化与链延长耦合。

关键技术方法包括：以 ALECO70（经 70% CO 适应后的 JS66 进化株）为亲本，在 CO₂:H₂=30:70 加压条件下连续传代 95 轮并分离单克隆获得 ALECO2；对 ALECO70 与 ALECO2 进行全基因组重测序（WGrS）与 de novo 组装；以 Clostridium carboxidivorans P7 核心代谢模型为基础，用实验测得的葡萄糖摄取、H₂/CO₂ 交换及乙酸/乙醇速率作约束，进行通量平衡分析（FBA）与 optGpSampler 随机通量采样；在批式与补料批式血清瓶体系中设置葡萄糖喂料、葡萄糖/H₂、葡萄糖/CO₂/H₂ 三类混养条件，并以 GSP-25 树脂原位吸附 C6 产物。

3.1 JS66 的混养行为：批式葡萄糖发酵显示 24 h 内葡萄糖耗尽，初期 CO₂ 与 H₂ 积累，后期才被 WLP 利用；C_M/C_S 仅 0.59，无糖自养时 CO₂ 利用速率也偏低。结论为 JS66 固有气体利用速率不足以抵消糖代谢产 CO₂，限制混养固碳。

3.2 增强 JS66 的 CO₂ 消耗速率的 ALE：ALECO70 相较 JS66 已有更强气利用；95 轮 ALE 后 CO₂ 消耗速率由 0.021 升至 0.21 mmol/h，H₂ 由 0.05 升至 0.56 mmol/h。筛选所得 ALECO2 在自养下无滞后即消耗气体，24-48 h 的 CO₂ 消耗速率为 JS66 的 9.5 倍；5 g/L 葡萄糖批式中 24 h 的 C_M/C_S 达 0.71，超过异养理论值 0.67。

3.3 ALECO2 的 H₂ 混养批式发酵：外源 H₂ 下 ALECO2 于 48 h 完全再同化 CO₂，96 h 消耗 H₂ 53.5 kPa；JS66/ALECO70 残留 CO₂ 明显。产物上 AA/BA 下降，EtOH/BuOH 与 HA/HeOH 上升。C2 占比降至低位，C6 碳占比 42%；C_M/C_S 达 0.95，接近 1.0，说明 H₂ 供电子使发酵源 CO₂ 近完全再同化且通量转向 C6。

3.4 补料批式中共利用葡萄糖、H₂、CO₂ 增强固碳与链延长：F_mixo 无外源气，CO₂ 累积至 50.6 kPa，C_M/C_S 0.60，C6 占 28%。F_H₂mixo 中 CO₂ 再同化快于生成，HA 7.14 g/L 前体为 5.36 g/L，C6 占 49%，醇类占 37%，C_M/C_S 0.91。F_CO₂/H₂mixo 额外喂 CO₂，净耗外源 CO₂ 1.26 C-mmol，HA 7.14 g/L，C6 占 57%，C_M/C_S 1.10，实现碳负型发酵。

3.5 胞内碳通量重分布的计算机模拟：以 P7 模型采样显示 F_mixo 下 PYR::AcCoA 主导，WLP 的 CH3-Co-E::AcCoA 低；F_H₂mixo 与 F_CO₂/H₂mixo 中 WLP 来源乙酰辅酶 A 及逆向 β-氧化（reverse β-oxidation）的 AcCoA::AcAcCoA、ButCoA::3-KetHexCoA 通量上调，与实验中 C_M/C_S 1.10 和 C6 占 57% 一致。

3.6 ALECO2 增强 CO₂ 利用的基因组基础：ALECO2 相对 ALECO70 有 7 个突变，包括 Q6H37_RS05210（NADH-泛醌氧化还原酶-F 铁硫结构域蛋白）41 bp 插入致框移，该蛋白与电子分叉 Hyt 氢酶复合体 HytB 同源；LysR 家族转录调控因子两个错义突变；另见 rhamnulokinase 无义突变。ALECO70/ALECO2 相较 JS66 有 63.1 kb 缺失，边界为重复基因盒（DUF6431、DDE 型整合酶/转座酶、AAA ATPase），提示同源重组删除。研究人员指出这些为候选机制，需反向工程验证。

讨论部分总结：研究证明单菌 ALECO2 可在葡萄糖丰富条件下同时完成 CO₂ 同化与中链酸生物合成，避免共培养的比例与种间协调难题；H₂ 与 CO₂/H₂ 补充通过 WLP 来源 acetyl-CoA 进入 reverse β-oxidation 促进 C6 链延长，为碳保存型中链羧酸生产提供进化驱动型单菌平台；基因组突变提示 HytB 同源物与 LysR 调控子可能参与气代谢重塑，但因果需实验证实。

结论部分翻译：本研究建立 ALECO2 这一进化型厌氧非光合混养平台，将葡萄糖发酵与 H₂ 辅助 CO₂ 再同化及链延长相耦合。H₂ 混养批式下 ALECO2 近完全再同化葡萄糖源 CO₂，碳摩尔得率（C_M/C_S）达 0.95；补料批式下 H₂ 补充使 C_M/C_S 由 0.60 升至 0.91，C6 碳比例由 28% 增至 49%；同时补 H₂ 与 CO₂ 进一步使 C_M/C_S 达 1.10，C6 碳比例达 57%，实现碳负型发酵。基因组分析发现假想 HytB 同源物与 LysR 型转录调控因子突变。据研究人员所知，这是首个将混养、外源 CO₂ 同化与增强 C6 生产整合于进化产乙酸单菌的报道。ALECO2 是碳负型高值中链产物生产的有前景平台。