基于流式拉曼激活细胞分选对海洋固碳细菌的功能筛选与单细胞培养

《Bioresource Technology》：Functional screening and single-cell cultivation of marine CO 2-fixing bacteria via flow-mode Raman-activated cell sorting

　　

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  scRACS-Culture培养法可在7天内分离出活性海洋CO₂固定细菌。
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  香根鸢尾伯克氏菌（Paraburkholderia aromaticivorans）FR-4将亚硝酸盐氧化与CO₂固定偶联。
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  菌株FR-4表现出灵活的代谢自养特性及二甲苯降解能力。

引言

海洋CO₂固定微生物是海洋碳循环的核心参与者，它们介导了初级生产力中的相当大比例，以及从表层水体向深层的碳转移。在黄海等沿海和陆架系统中，微生物驱动的有机碳循环可能主导初级生产力，而微生物产生的胞外聚合物（EPS）促进了"海雪"的形成和沉降，从而实现更长期的碳输出（Gruber等，2023；Li等，2024b；Yue等，2023）。根据碳固定的能量来源，它们主要分为光自养菌和化能自养菌（Hügler和Sievert，2011）。这些微生物通过介导无机碳固定，在维持区域碳汇平衡方面发挥着不可或缺的作用。例如，在黄海大陆架区域，微生物驱动的有机碳循环贡献了表层水体初级生产力的高达87%（Gruber等，2023）。据估计，该群体介导的碳转移过程占陆架和海洋碳通量的相当大比例，是实现"生物碳泵"功能的重要组成部分。此外，特定的CO₂固定菌群将碳循环与氮循环偶联，以支持化能自养碳同化。这些类群能在深海、沉积物等无光区，或在特定营养条件下真光层底部附近主动固定碳，从而在局部生物地球化学循环中发挥独特作用（Dang和Chen，2017）。

然而，此类微生物资源的鉴定仍然受到传统"先培养、后筛选"范式的限制。原位功能与培养分离株之间的脱节，使得海洋微生物组研究主要局限于标记基因分类推断，特别是对于那些丰度低但生物地球化学影响不成比例的低丰度化能自养菌。这一差距源于三个关键瓶颈。（i）绝大多数海洋CO₂固定细菌仍处于不可培养状态，这是由于复杂的生态位分化和未确定的营养需求，难以在合成培养基中再现，导致大量潜在菌株被遗漏（Amann等，1995；Whitman等，1998）。（ii）即使成功分离的菌株，其生长速率也显著低于异养细菌（倍增时间为数周至数月，而后者仅需数小时），大大延长了从采样到纯培养的周期（Connon和Giovannoni，2002；Rappé等，2002；Xu等，2023）。（iii）实验室检测到的CO₂固定活性与原位CO₂固定活性之间存在显著差异，因为受控条件与动态海洋环境截然不同，基因转录依赖于特定生态位特征；菌株可能在优化实验室条件下具有活性，但因缺乏环境信号而在原位失效，导致筛选过程中的功能误判（Grüterich等，2025；Llirós等，2011）。

为应对这些挑战，单细胞拉曼光谱（SCRS）作为一种强大的、无标记、无侵入的工具，已能够基于内源性分子振动来表征生物化学和功能表型（He等，2019；Huang等，2009）。当与稳定同位素探针（拉曼-SIP）联用时，SCRS能够通过监测通用生物量标记物（如苯丙氨酸）的同位素诱导拉曼位移，或共振增强色素（如类胡萝卜素）来实现CO₂固定活性的定量检测（Cui等，2018；Jing等，2018；Li等，2012a；Tao等，2017）。利用这一诊断能力，拉曼活化细胞分选（RACS）实现了对代谢活性CO₂固定细菌的靶向分离（Li等，2012b；Wang等，2016）。后续的技术突破将功能表型与基因型联系起来，包括通过拉曼活化细胞喷射（RACE）进行靶向宏基因组学（Jing等，2018），以及通过RACE（Song等，2017）或拉曼活化重力驱动包封（RAGE）（Jing等，2022b）进行单细胞基因组学。至关重要的是，除了基因组探索之外，这些单细胞分选平台还实现了对活细胞的靶向回收，以便后续培养。虽然这种"先筛选、后培养"的方法直接捕获了原位活性功能菌株，但下游培养仍然受限于微尺度营养培养基，培养基优化仍然是通量瓶颈。尽管如此，这种高通量获取能力大大改善了下游复苏和培养效率，为环境、生理和生物技术应用提供了可靠的活培养资源。虽然这些功能分选策略已成功分离出特殊微生物（Jing等，2022a；Li等，2024a；Wang等，2026），如活性污泥中的聚磷菌（Jing等，2022a）和耐酸铝土壤细菌（Diao等，2024），但其应用于海洋生态系统仍属未充分探索的领域。为弥合海洋环境中代谢潜力与可培养性之间的鸿沟，我们开发了一种整合¹³C-HCO₃^?标记与单细胞拉曼活化细胞分选及培养（scRACS-Culture）的靶向工作流程（图1）。以黄海海水作为模型系统，通过单细胞拉曼光谱监测¹³C同化，确定24小时为最佳分选窗口。该方法在7天内获得了6株无菌功能菌株，包括核心分离株香根鸢尾伯克氏菌（Paraburkholderia aromaticivorans）FR-4——一种新型兼性化能自养亚硝酸盐氧化细菌（NOB），能够以NO₂^?和CO₂/HCO₃^?自养生长，同时保留异养灵活性。通过将原位CO₂固定活性直接与基因型和表型联系起来，该工作流程克服了传统培养的关键局限，为获取难以驯化的海洋CO₂固定细菌提供了靶向策略。更重要的是，该方法解锁了兼具化能自养和芳香族降解双重功能的微生物资源，为环境生物修复提供了宝贵的生物材料。

各节摘要

菌株、培养基及培养条件

三种细菌菌株——束丝藻（Synechococcus elongatus）PCC7942、红假单胞菌（Rhodopseudomonas palustris）ACCC10649和异色弧菌（Allochromatium vinosum）DSM180——均从实验室保藏菌种中获取。S. elongatus PCC7942和R. palustris ACCC10649分别在BG11培养基和RPM培养基中培养。A. vinosum DSM180在厌氧条件下制备的Pfennig培养基中维持（见补充材料）。所有培养物均在200 rpm、30°C的摇床中培养5天，并在

从海水中鉴定、分离和培养CO₂固定细菌的工作流程

scRACS-Culture系统与传统培养工作流程的比较突显了在靶向分离CO₂固定细菌方面的重要技术优势（图1）。传统的"先培养"范式通常依赖于重复富集和琼脂平板法；这种盲目筛选过程不仅耗时费力，还引入了严重的培养偏差，整体周期通常超过90天（Connon和Giovannoni，2002；Rappé等，2002；Xu

化能自养与芳香族降解双重功能在沿海生物修复中的生物技术意义

传统范式长期以来将伯克氏菌属（Paraburkholderia）定义为典型的有机营养降解菌，主要栖息于陆地或沿海环境。然而，在黄海真光层发现FR-4菌株挑战了这一单一功能叙事。基因组重建显示，FR-4已成功整合了以rbcL/rbcS为核心的CBB循环和由nxrAB编码的亚硝酸盐氧化系统，同时保留其高效的芳香族降解

结论

本研究建立了一个原位代谢活性驱动的单细胞拉曼活化细胞分选与培养（scRACS-Culture）框架，将海洋微生物探索从描述性分类学分析转向靶向功能单细胞分离。优化的SIP耦合流动式拉曼分选将功能菌株发现时间从数月缩短至约7天，获得了6株低于标准测序阈值的无菌谱系。香根鸢尾伯克氏菌（Paraburkholderia aromaticivorans）的多组学验证

CRediT作者贡献声明

程东：撰写——初稿，方法论。徐之光：撰写——审阅与编辑，方法论，调查研究，概念构思。任一尚：撰写——初稿，调查研究，形式化分析。潘惠惠：软件，形式化分析。马广霞：资源，调查研究。邵宗泽：撰写——审阅与编辑，概念构思。Emma Rocke：撰写——审阅与编辑，概念构思。焦晓燕：撰写——审阅与编辑，监督，方法论，资金获取，

未引用参考文献

Gibson等，2002；Hall等，2023；Klaysubun等，2024；Qian和Tabita，1996；Shatila等，2013；Trutko等，2005。

利益冲突声明

作者声明，他们没有已知的竞争性经济利益或个人关系可能影响本文所报告的工作。

致谢

本研究由国家自然科学基金委员会资助（项目编号：32270109和32570103）。

核苷酸序列登录号

所有序列数据集已存入NCBI SRA数据库。16S rRNA基因扩增子测序数据可在BioProject PRJNA1453400下获取（登录号SRR38092743–SRR38092760），菌株FR-4的全基因组序列归档于BioProject PRJNA1438582下（登录号SRR37658164）。

程东|徐之光|任一尚|潘惠惠|马广霞|邵宗泽|Emma Rocke|焦晓燕|许建