肥大细胞通过内质网应激机制抑制胶质母细胞瘤的进展

《Brain Research》：Mast cells suppress glioblastoma progression via endoplasmic reticulum stress

　　

摘要

目的

肥大细胞（MCs）是胶质母细胞瘤（GBM）中主要的浸润免疫细胞，并被认为与肿瘤发展有关；然而，它们在GBM进展中的作用及其潜在机制仍不清楚。本研究旨在表征MCs在GBM中的分布情况、MCs在GBM进展中的功能作用以及相关的调控机制。

方法

首先，我们使用CIBERSORT算法根据TCGA数据确定了MCs在GBM中的分布情况，并通过临床GBM组织样本进行了验证。使用R语言包来评估MCs对GBM患者的预后影响。随后进行了体外和体内实验，以确定MCs对GBM表型的影响。接下来，对用或不用MCs处理的GBM细胞进行了高通量RNA测序，以筛选差异表达基因。通过基因本体（GO）分析和京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路分析，确定了参与MCs介导的GBM调控的关键信号通路。最后，我们使用透射电子显微镜观察超微结构、CCK-8实验检测细胞活力、Western blotting检测基因表达和调控关系，以及流式细胞术检测凋亡，以验证该通路在MC介导的GBM凋亡中的关键调控作用。

结果

我们观察到激活态和静息态MCs在GBM中的分布有显著差异。此外，用C48/80药理激活MCs可以在体外抑制GBM细胞的生长并诱导其凋亡，在体内也能抑制肿瘤生长。GO和KEGG分析显示，许多排名靠前的通路与免疫反应相关，其中经典的osteoclast分化通路最为突出。进一步的通路分析和生物学验证表明，内质网应激（ERS）是通过MCs抑制GBM进展的关键凋亡通路。

结论

本研究表明，MCs主要以静息状态浸润GBM组织，而用C48/80药理激活MCs可以诱导GBM细胞的内质网应激（ERS），从而抑制肿瘤进展。这些发现对于理解MCs对抗GBM增殖的抗肿瘤作用以及评估GBM对MCs靶向免疫治疗的潜在反应非常重要。

引言

胶质母细胞瘤（GBM）是中枢神经系统中最常见的原发性恶性肿瘤，起源于神经胶质干细胞或神经前体细胞。尽管已经建立了标准治疗方案，但GBM的复发率仍然很高，生存率很低。随着对GBM的深入研究，研究人员发现GBM由肿瘤细胞和多种非肿瘤细胞组成。它们之间的相互作用形成了独特的肿瘤微环境（TME）（Bikfalvi等，2023年）。TME包含基质细胞、免疫细胞和信号分子。

此外，免疫细胞因其在GBM中的双重作用而受到特别关注（Dapash等，2021年）。作为机体防御的重要组成部分，免疫细胞在肿瘤生长中起着抑制作用；相反，免疫细胞也会释放促炎性趋化因子来促进肿瘤生长（Coussens和Werb，2002年）。因此，探索免疫细胞与GBM之间的关系将有助于改善肿瘤结局。肥大细胞（MCs）作为中枢炎症的先驱（Sandhu和Kulka，2021年），会在GBM肿瘤组织中积聚（P?lajeva等，2011年）。然而，MCs在GBM进展中的作用仍不明确。

MCs通过释放多种生物介质、调节靶细胞和刺激免疫反应，在组织损伤和疾病发展中起着重要作用（Forsythe，2019年；Kempuraj等，2020年）。MCs是最早浸润肿瘤组织的免疫细胞之一（Komi和Redegeld，2020年；Lichterman和Reddy，2021年）；并且炎症趋化因子会促进MCs向肿瘤组织的募集，这些趋化因子部分由肿瘤细胞分泌（Lv等，2019年；Xiong等，2019年）。Jelena P?lajeva观察到，MCs可能因GBM细胞分泌的巨噬细胞迁移抑制因子而被吸引（P?lajeva等，2014年）。此外，Ananya Roy证实，胶质瘤来源的纤溶酶原激活抑制剂可以介导MCs的激活和浸润到GBM中（Roy等，2015年）。

MCs的浸润与肿瘤预后密切相关（Hempel Sullivan等，2020年；Mao等，2018年）。多项研究表明，MCs对乳腺癌、前列腺癌、非小细胞肺癌和直肠癌的预后有积极影响（Rajput等，2008年；Hempel等，2017年；Shikotra等，2016年；Mehdawi等，2016年）。MCs可以通过分泌白细胞介素（IL）-4、IL-6、肿瘤坏死因子（TNF）-α和INF-γ直接对肿瘤细胞发挥抗肿瘤作用，从而诱导细胞毒性；或者通过释放细胞因子间接招募和激活其他免疫细胞（包括淋巴细胞、巨噬细胞、中性粒细胞和嗜酸性粒细胞），以调节抗肿瘤免疫（Guo等，2023年；Rigoni等，2015年）。然而，也有报告称MCs可能促进肿瘤进展（Marichal等，2013年）。不过，MCs在GBM中的作用仍存在争议。Roy等人发现，MBM组织中MC的积聚与患者预后较差显著相关（Roy等，2015年），这表明MCs可能促进肿瘤进展。相反，流行病学研究显示MCs与GBM风险呈负相关（Turner，2012年；Hemelrijck等，2024年）。因此，需要进一步研究MCs在GBM中的作用和分子机制。

在这项研究中，我们旨在探讨MCs如何影响GBM的进展。我们观察到GBM组织中存在两种类型的MCs：静息态和激活态。根据已发表的方法（Song等，2023年）制备了条件培养基（CM），以研究免疫细胞与肿瘤细胞之间的相互作用。体外实验表明，从用C48/80激活的P815细胞系中提取的CM可以抑制GBM细胞系GL261细胞的生长并诱导其凋亡；然而，它并未影响这些细胞的迁移，这表明激活态MCs在GBM进展中具有保护作用。通过RNA测序（RNA-seq）观察到，激活态MCs通过诱导GBM细胞的内质网应激（ERS）来抑制肿瘤进展。

章节片段

试剂和抗体

化合物48/80（C48/80，C2313）和牛磺酸脱氧胆酸（TUDCA，580549）从Sigma-Aldrich（德国）购买。Tunicamycin（TM，A594348）和thapsigargin（TG，A370143）从AmBeed（中国）购买。化合物48/80和TUDCA溶解在ddH₂O中。TM和Thapsigargin溶解在DMSO（D8371，Solarbio，中国）中，并用DMEM稀释后用于后续实验。辣根过氧化物酶（HRP）-抗兔IgG（7074P2）和HRP-抗鼠IgG（7076S）来自Cell Signaling Technology。

GBM组织中MCs浸润的特征

为了探索GBM组织中MCs的浸润模式，我们首先使用TCGA数据的CIBERSORT分析来识别浸润GBM的免疫细胞。结果（图1A）显示，MCs是GBM中的22种免疫细胞之一，根据激活状态可分为静息态和激活态MCs。我们比较了GBM组织和正常脑组织中这些免疫细胞的丰度，并观察到MCs的浸润存在差异。具体来说，GBM组织中的MCs数量显著更高

讨论

目前，MCs在GBM进展中的作用仍不完全清楚。作为免疫细胞的一种，MCs可以释放多种促炎因子，包括IL-6、TNF-α、INF-γ等，从而促进炎症并抑制肿瘤增殖（Guo等，2023年）。相反，MCs还会释放多种血管生成因子，包括VEGF、FGF-2和TGF-β，这些因子促进肿瘤血管生成并为肿瘤生长提供必要的营养物质（Komi和Redegeld，2020年6月）。

结论

总体而言，我们观察到GBM组织和正常脑组织中MCs的浸润存在形态学差异，GBM组织中的静息态MCs比例较高，激活态MCs比例较低。用C48/80药理激活MCs可以在体外抑制GBM细胞的ERS通路，并在体内抑制肿瘤生长。然而，这项研究存在一些局限性。首先，机制结论主要基于单个GBM细胞系（GL261）和单个

CRediT作者贡献声明

Kai Yu：撰写——初稿；可视化；验证；方法学；正式分析；数据整理；概念构思。Shu Zhu：验证；方法学；正式分析；数据整理。Sha Yang：方法学；正式分析。Yunjia Hu：验证。Guoqiang Han：资源准备。Jiqin Zhang：撰写——审阅与编辑；调查。Chuan Xu：正式分析。Chaofei Chen：撰写——审阅与编辑。Chunju Fang：可视化。Xin Xiang：撰写——审阅与编辑；监督；资源准备。

资助

本研究得到了中国国家自然科学基金（编号82360376、82260533和82360482）、贵州省科技项目（编号ZK[2024]483和MS[2025]492）、GAST青年精英科学家资助计划（GASTYESS202414）、“942”计划的关键临床专项、贵州省通过****培养高层次创新人才的资金支持（gzwjrs2023-001和gzwjrs2024-007），以及贵州省人民医院青年

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文报告工作的利益冲突或个人关系。

致谢

作者感谢贵州省人民医院中央实验室提供的实验平台。

伦理声明

本研究获得了贵州省人民医院伦理委员会的批准（批准号EC Review (People and Animal) (2019)122，日期2019年6月5日）。本研究遵循美国国立卫生研究院关于实验室动物护理和使用的指南（第8版）以及赫尔辛基宣言进行。

数据可用性声明

所有相关数据

Kai Yu|Shu Zhu|Sha Yang|Yunjia Hu|Guoqiang Han|Jiqin Zhang|Chuan Xu|Chaofei Chen|Chunju Fang|Xin Xiang|Ying Tan|Guoqing Zhang

中国贵阳贵州省医学院附属医院神经外科 department