接种发酵过程中内比奥罗葡萄的产区相关微生物特征持续存在

《Applied and Environmental Microbiology》：Region-associated microbial signatures persist during inoculated fermentation of Nebbiolo grapes

　　

摘要 葡萄酒发酵由动态微生物群落驱动，这些群落影响发酵动力学和葡萄酒组成。在发酵过程中，优势酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）以及多样的非酿酒酵母（non-Saccharomyces）和细菌均积极参与代谢物和香气形成，可能反映葡萄园环境和地理特征。尽管人们对葡萄相关微生物群的空间结构兴趣日益增长，但对于这些微生物特征在接种发酵过程中的持续性，目前认识仍然有限。本研究对来自多个葡萄园的内比奥罗（Vitis vinifera cv. Nebbiolo）葡萄在接种发酵过程中的真菌和细菌群落进行了表征，并整合了化学和挥发性组（volatilome）数据。结果揭示了真菌和细菌群落中不同的时间动态和产区相关模式，以及相关的化学和挥发性特征差异。这些发现表明，葡萄相关微生物群的地理分化在接种发酵过程中得以维持，并与不同的微生物演替模式和化学特征相关联。 重要性 酵母和细菌群落在酒精发酵过程中的动态变化对塑造葡萄酒特征起决定性作用，采收时葡萄表面微生物群落的组成已知会影响发酵过程。在本研究中，与葡萄园地理相关的真菌和细菌群落模式在标准化接种发酵过程中保持可检测，尽管商业起始培养物占据主导地位。这些持续的微生物特征与微生物演替、化学组成和葡萄酒挥发性组的差异相关，支持了区域微生物印记在商业化酿酒条件下仍可检测的概念。

论文解读

一、研究背景与问题

葡萄酒发酵是一个由结构化微生物演替驱动的复杂生物学过程，对发酵动力学、化学组成和最终产品的感官属性具有强烈影响。尽管酿酒酵母通常在酒精发酵中占优势，但多样的非酿酒酵母在发酵早期和中期阶段发挥代谢活性，通过调节有机酸、甘油产生和香气前体释放，促进葡萄酒的差异化。近年来，风土（terroir）概念日益受到重视，表明与葡萄表面和葡萄汁相关的微生物群落受葡萄园位置、气候条件、土壤、植物部位、葡萄栽培实践和酿酒酵母基因型的影响。这些群落并非随机分布，而是表现出生物地理学结构，其中真菌群落对局部环境条件更为敏感。然而，以往研究多集中于自然发酵或葡萄园相关微生物群，接种发酵对葡萄园特异性微生物群落模式的影响在很大程度上尚未被探索。

内比奥罗葡萄品种以其苛刻的栽培要求和独特的酿酒特性而闻名，可酿造出高酸度、显著单宁和卓越香气复杂性的葡萄酒。前期研究已记录了非酿酒酵母的优势存在，包括葡萄汁有孢汉逊酵母（Hanseniaspora uvarum）、杆状星芒酵母（Starmerella bacillaris）和粉状梅奇酵母（Metschnikowia pulcherrima）等。乳酸菌如酒酒球菌（Oenococcus oeni）和乳杆菌属（Lactobacillus spp.）在苹果酸-乳酸发酵中发挥重要作用。内比奥罗在不同特征的葡萄栽培区种植，使其成为研究葡萄园特异性微生物群落在标准化接种发酵过程中是否保持地理身份的理想模型。

研究人员假设，地理上不同的内比奥罗葡萄园拥有不同的葡萄相关微生物群落，且这些地理差异在标准化接种发酵过程中持续存在，尽管商业起始培养物占主导地位。基于此框架，本研究旨在：（i）表征来自三个地理区域38个内比奥罗葡萄园葡萄汁的化学组成；（ii）描述发酵过程中真菌和细菌群落的时间动态；（iii）评估地理来源是否与初始微生物多样性和群落组成差异相关；（iv）评估接种发酵过程中地理模式在微生物群落中的持续性；（v）探索微生物谱、化学参数和葡萄酒香气组成之间的潜在关联。

二、研究设计与方法

本研究于2023年10月2日至11日期间，从意大利皮埃蒙特和伦巴第（瓦尔泰利纳）地区的38个内比奥罗葡萄园各采集25公斤健康葡萄浆果。三个地理区域包括北皮埃蒙特（North Piedmont，NP；15个葡萄园）、南皮埃蒙特（South Piedmont，SP；13个葡萄园）和瓦尔泰利纳（Valtellina，VT；10个葡萄园）。所有葡萄园均采用常规管理实践。酿酒过程在都灵大学Bonafous实验酒窖进行，每个葡萄样品经去梗破碎后，在20升玻璃坛中进行发酵，按制造商说明接种20 g/hL的酿酒酵母Lalvin BRL97活性干酵母，在25°C控温条件下进行14天浸渍。在发酵第0、3、7和14天四个时间点采样，每个样品采集三个技术重复。研究整合了多种关键技术方法：采用QIAcube HT系统提取基因组DNA，分别扩增26S rRNA基因D1结构域和16S rRNA基因V3-V4区域，在NovaSeq PE250平台进行扩增子测序；使用QIIME2软件进行生物信息学分析，通过DADA2插件生成扩增子序列变体（ASV），并分别比对SILVA数据库和自定义26S rRNA数据库进行物种分类；采用高效液相色谱分析糖、苹果酸、乙酸、乳酸、甘油和乙醇等化学参数；采用顶空固相微萃取结合气相色谱-质谱联用（HS-SPME-GC-MS）分析游离挥发性化合物；统计方面采用主成分分析（PCA）及稀疏主成分分析（SparsePCA）、置换多元方差分析（PERMANOVA）、指示物种分析、Spearman秩相关和envfit分析等方法。

三、主要研究结果

（一）内比奥罗葡萄和葡萄汁中微生物群落的动态

研究人员对来自38个葡萄园的152个样品进行了分析，共获得18,659,648条16S rRNA序列和60,046,100条26S rRNA序列，解析为451个细菌和290个真菌ASV。SparsePCA分析显示，真菌群落在第0天主要分布在左下象限，第3天沿PC1正方向移动，第7天和第14天沿PC2正方向移动；细菌群落呈现相似但方向相反的趋势。核心真菌类群包括酿酒酵母、杆状星芒酵母和变形 Aureobasidium proteae，核心细菌属包括乳杆菌属（Lactobacillus sensu lato）、链球菌属（Streptococcus）和梭菌属（Clostridium）等。

（二）不同葡萄园内比奥罗碎葡萄微生物群落的变异

在接种前的碎葡萄样品中，真菌ASV丰富度在三个地理区域间无显著差异，而细菌ASV丰富度在VT区域显著高于SP和NP区域。PERMANOVA分析显示，真菌（R2 = 0.197，P = 0.001）和细菌（R2 = 0.197，P = 0.003）群落的β多样性均存在显著地理差异，地理来源解释了约20%的群落组成变异。SP区域真菌以A. proteae（25.0%）为主，VT和NP区域以杆状星芒酵母为主（分别为41.7%和28.5%）。细菌群落中，SP区域以葡糖杆菌属（Gluconobacter，32.0%）为主，VT和NP区域以Komagataeibacter属为主（分别为32%和11.8%）。

（三）接种发酵过程中区域相关微生物群落的时间动态与持续性

PERMANOVA分析确认采样时间和地理区域均显著影响真菌（P < 0.001，共同解释73.5%变异）和细菌（P < 0.001，共同解释29.4%变异）群落组成。热图分析显示，NP区域在早期与耐乳酸的 Lachancea thermotolerans、Pichia californica 和拜耳接合酵母（Zygosaccharomyces bailii）呈强正相关；SP区域与汉逊酵母属（Hanseniaspora spp.）、链格孢属（Alternaria spp.）、枝孢属（Cladosporium spp.）等关联较强；VT区域则以 Debaryomyces hansenii、Pichia kluyveri 和杆状星芒酵母为特征。指示物种分析分别鉴定了22种真菌和26个细菌属与特定区域显著关联。酿酒酵母在所有区域均呈现延迟增长模式，早期丰度低，后期增加。

（四）化学参数及其与微生物生态的关联

化学分析显示，VT区域总酸度较高、pH较低。SP区域在发酵各阶段糖含量和乙酸含量显著高于其他区域，而NP和VT区域的苹果酸浓度始终较高。发酵结束时，SP区域乙醇含量（13.52% vol/vol）显著高于NP（12.07%）和VT（12.53%）。PERMANOVA分析表明发酵时间解释了化学组成变异的主要部分（R2 = 0.598，P = 0.001），而地理来源本身不显著。第0天的化学参数已存在显著地理差异（R2 = 0.60，P = 0.001）。相关性分析显示，不同区域的微生物类群与环境参数和化学参数之间存在区域特异性的关联模式。

（五）葡萄酒挥发性组的地理模式及相关微生物群落

发酵结束6个月后，GC-MS分析检测到39种挥发性化合物。经Varimax旋转的PCA分析显示，SP和NP样品沿第一和第三象限角平分线清晰分离，VT样品因采样区域有限而类内变异较小。仅比较SP和VT时，PERMANOVA确认挥发性组存在显著地理分离（R2 = 0.251，P < 0.05）。envfit分析显示，A. alternata、Cladosporium spp.和Alternaria spp.与乙酯类化合物正相关，而A. niger和德尔布有孢圆酵母（Torulaspora delbrueckii）与醇类和萜烯类相关。细菌中仅醋杆菌属（Acetobacter）、假单胞菌属（Pseudomonas）和葡萄球菌属（Staphylococcus）在分析中显著，均与醇类和萜烯类正相关。

四、讨论与结论

研究表明，内比奥罗葡萄在接种发酵早期阶段微生物多样性较高，随酿酒酵母优势化而逐渐下降。尽管接种可预测地驱动了酿酒酵母的优势，但多种非酿酒酵母类群在整个发酵过程中保持可检测，表明部分原始葡萄园相关群落结构在接种后得以保留。真菌群落表现出比细菌群落更强的生物地理学信号，地理来源和采样时间解释了真菌群落变异的73.5%，而仅解释了细菌群落的29.4%。这一发现支持了真菌群落对葡萄栽培和气候条件更为敏感的结论。

研究结论指出，地理上不同的内比奥罗葡萄园拥有分化的葡萄相关微生物群落。尽管接种了商业起始培养物，部分初始生物地理结构在发酵过程中得以保留。真菌种群，特别是非酿酒酵母，表现出可辨别的生物地理模式，与环境和当地气候条件相关。细菌群落表现出较弱的地理结构，但保留了功能多样性。气候和环境条件与葡萄微生物群组成相关，较凉爽条件有利于冷适应发酵类群，较温暖环境促进耐热和土壤来源微生物。虽然观察到微生物类群与挥发性化合物之间的相关性，但这些关系应被解释为区域相关微生物特征与葡萄酒挥发性组成之间的关联，而非接种发酵条件下本地微生物直接因果作用的证据。这些发现表明，标准化接种发酵不会完全掩盖区域微生物特征，支持微生物风土作为商业酿酒条件下可检测的生态印记的概念。由于本研究仅基于单一采收年份，未来需要多年份分析以验证这些模式的持续性、评估核心发酵微生物群的稳定性，并区分位点特异性效应与年度变异性。