金黄色葡萄球菌对多种营养性硫补充的转录适应

《Journal of Bacteriology》：Defining the transcriptional adaptation of Staphylococcus aureus to a range of nutritional sulfur supplementation

　　

摘要 细菌病原体必须适应动态的宿主组织环境才能增殖。因此，进化出了精密的调控系统以克服宿主带来的挑战并满足营养需求。硫是必需的常量营养素，革兰氏阳性菌如金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）通过利用转录抑制因子CymR来平衡这一营养需求。以往的研究通过比较在富含胱氨酸（Cys）的富培养基中培养的cymR突变体与野生型细胞所产生的转录本，定义了金黄色葡萄球菌的CymR调控子。本研究在化学限定生长条件下定义了金黄色葡萄球菌CymR依赖性和非依赖性的硫饥饿响应。结果表明，硫饥饿与硫充足条件下的CymR调控子表现出相当大的重叠，包括先前注意到的铁获取、氧化应激和硫代谢之间的联系。含硫谷胱甘肽（GSH）可减轻血红素和过氧化氢毒性的发现进一步验证了铁获取、氧化应激和硫代谢之间的联系。除GSH外，Cys和硫代硫酸盐也能满足金黄色葡萄球菌的硫需求。研究人员量化了对有机（半胱氨酸、胱氨酸、还原型GSH和氧化型GSH）或无机硫代硫酸盐的转录响应，揭示了硫源特异性表达模式。硫代硫酸盐诱导了最大数量的差异表达基因。因此，硫代硫酸盐转运蛋白（SAUSA300_RS10985）已被证实是金黄色葡萄球菌在以硫代硫酸盐为硫源时生长所必需的。此外，研究人员证明了一个与SAUSA300_RS10985操纵子相邻的假设蛋白SAUSA300_RS10980支持在硫代硫酸盐上的最大生长。总的来说，本研究提供了一个资源丰富的转录组学框架，强调了金黄色葡萄球菌硫代谢的动态特性。 重要性 机会性病原体金黄色葡萄球菌在多种宿主环境中增殖，因此是医院获得性感染的主要原因。在定殖过程中，金黄色葡萄球菌必须获取硫等必需营养素才能生存。为满足营养需求并维持稳态以避免对细菌生理产生不利影响，细菌会调控获取宿主来源代谢物的机制。本报告研究了金黄色葡萄球菌在体外不同硫补充状态下的调控响应，增强了研究人员对葡萄球菌硫代谢的认识，并代表了一个信息库，将指导未来围绕金黄色葡萄球菌硫获取和代谢的研究。

金黄色葡萄球菌硫代谢转录适应机制的系统性解析

一、研究背景与科学问题

金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）作为重要的机会性病原体，能够在大多数脊椎动物器官中适应并增殖，是医院获得性感染的主要病原菌之一。这种广泛的适应性要求细菌能够感知并响应细胞外环境，从宿主中获取必需营养素。硫是细菌必需的常量营养素，在细胞内主要以半胱氨酸（Cys）形式储存，参与蛋白质合成、辅因子合成及氧化还原平衡等众多细胞反应。然而，与铁类似，细胞内Cys过量会促进Fenton化学反应，导致DNA、蛋白质和Fe-S簇的氧化损伤。因此，对硫代谢的严格控制及其与铁稳态的协调对细菌增殖至关重要。

金黄色葡萄球菌硫稳态的主要调控因子是半胱氨酸代谢抑制因子CymR。与金属调控因子不同，CymR通过两种方式间接感知Cys水平以调节DNA结合活性：其一，细胞内Cys水平通过硫同化中间产物O-乙酰丝氨酸（OAS）传递，Cys充足时OAS耗竭，CysK与CymR形成复合物激活抑制；其二，CymR通过其第25位唯一的Cys残基响应细胞氧化状态。此前的研究虽然在富培养基中定义了CymR调控子，但尚未系统评估金黄色葡萄球菌在硫饥饿条件下的转录响应，也未比较不同硫源（有机硫源如Cys、胱氨酸（CSSC）、GSH、GSSG与无机硫源如硫代硫酸盐（TS））对转录组的影响。此外，硫饥饿与铁获取、氧化应激之间的调控联系及其生物学意义仍需进一步阐明。

二、研究内容与主要结论

该研究发表于《Journal of Bacteriology》，旨在系统定义金黄色葡萄球菌在CymR依赖性和非依赖性条件下的硫饥饿转录响应，并比较不同硫源补充下的转录适应机制。研究人员采用化学限定培养基（CDM），以当前流行株USA300 LAC衍生物JE2为野生型（WT），结合cymR转座子突变体（cymR::Tn），通过RNA-seq技术系统分析了硫充足与硫饥饿条件下的转录组变化。研究发现，WT硫饥饿响应涉及546个差异表达基因（425个上调，121个下调），远大于此前报道的CymR调控子规模。通过比较WT与cymR::Tn的转录组，研究人员区分了CymR依赖性和非依赖性响应，其中133个基因属于CymR非依赖性硫饥饿响应。研究还证实了硫饥饿与铁获取、氧化应激基因诱导之间的密切联系，并发现含硫GSH能够缓解血红素和过氧化氢毒性。在不同硫源比较中，无机硫代硫酸盐诱导了最大数量的差异表达基因（399个），并鉴定出硫代硫酸盐转运蛋白TsuAB（SAUSA300_RS10985和SAUSA300_RS10980）为金黄色葡萄球菌利用TS所必需。

三、关键技术方法

该研究主要采用了以下关键技术方法：以金黄色葡萄球菌JE2（USA300 LAC衍生物）为野生型菌株，从内布拉斯加转座子突变体文库（NTML）转导获得cymR::Tn等转座子失活突变体；利用pKK22-PtcyP-YFP转录报告质粒监测硫饥饿诱导条件；采用Illumina HiSeq平台进行链特异性总RNA测序（2×150 bp双端测序），平均每样本获得2140万条双端读段；使用Geneious Prime软件进行序列比对和DESeq2差异表达分析（筛选标准为log2FC≥1且校正P值<0.05）；通过eggNOG-mapper v2进行COG功能分类，利用BioCyc进行Fisher精确检验富集分析；采用AlphaFold3预测蛋白质结构并与实验解析的E. coli TsuAB结构（PDB 8K1R）进行结构叠合比较。

四、研究结果

硫饥饿与CymR转录组的整合精炼了金黄色葡萄球菌硫代谢基因库

研究人员首先建立了硫饥饿诱导条件，通过tcyP启动子-YFP报告系统验证了WT在硫耗竭2小时后可诱导硫饥饿响应。RNA-seq分析显示，硫充足条件下cymR::Tn突变体中有62个基因差异表达（45个上调，17个下调），其中10个与此前报道的16个CymR调控硫代谢基因重叠。通过整合功能相关和预测共转录的基因，研究人员将CymR调控的硫代谢与获取基因库扩展至25个基因，包括新发现的GSH获取操纵子gisABCD-ggt和两个假定ABC转运体。在硫饥饿WT中，25个基因中有24个被诱导表达，验证了实验方法的有效性。

金黄色葡萄球菌硫饥饿响应并非完全由CymR调控

硫饥饿的cymR::Tn突变体中有250个基因差异表达（170个上调，80个下调），其中133个与WT硫饥饿响应重叠，表明存在显著的CymR非依赖性调控。COG分析显示，未知功能基因是硫饥饿CymR非依赖性调控子中最大的类别。WT硫饥饿响应中约200个基因属于未知功能或无同源物类别，提示金黄色葡萄球菌硫饥饿响应仍有大量未解之谜。此外，117个基因仅在cymR::Tn硫饥饿条件下差异表达，可能反映了CymR缺失后的补偿性响应。

硫限制期间铁获取和氧化应激响应基因被诱导

在硫饥饿WT的546个差异表达基因中，33个编码转录调控因子，包括铁获取调控因子Fur和过氧化物应激调控因子PerR。45个Fur调控基因中有29个在硫饥饿时上调，8个PerR调控基因中有6个上调。铁获取基因如ftnA、fer、fhuD2、isdG等显著诱导。部分铁获取基因（如fhuB、fhuG）仅在WT中上调，表明受CymR控制；而14个涉及铁载体生物合成和Fe-S簇组装的基因仅在cymR::Tn饥饿条件下上调，包括氧化还原应激调控因子HypR。功能实验表明，GSH（而非GSSG）能够以剂量依赖方式缓解血红素对WT和hrtA::Tn突变体的毒性，且高浓度GSH预载可显著提高细菌对H2O2的存活率。

适应不同营养硫源诱导金黄色葡萄球菌独特的转录响应

研究人员比较了WT在CSSC、Cys、GSSG、GSH和硫代硫酸钠（sTS）五种硫源下的转录组。Cys补充仅导致6个基因差异表达，而sTS诱导了最多399个差异表达基因（231个上调，168个下调），GSSG和GSH分别诱导168个和201个。sTS条件下有17个转录调控因子表达改变，其中11个为sTS特有。值得注意的是，vraR在所有三种条件下均下调。

TsuAB介导金黄色葡萄球菌对硫代硫酸盐的利用

SAUSA300_RS10985（985）和SAUSA300_RS10980（980）在所有硫源补充数据集中均显著上调，且与E. coli硫代硫酸盐摄取蛋白TsuA和TsuB分别具有57%/74%和62%/80%的氨基酸同一性/相似性。AlphaFold3预测结构与E. coli TsuAB实验结构（PDB 8K1R）的叠合显示显著结构相似性。遗传实验表明，985::Tn突变体在以sTS为唯一硫源时无法增殖，而表达985可部分恢复生长，共表达985/980操纵子可完全恢复。980单独表达不能恢复生长，提示其发挥辅助作用。基于此，研究人员建议将985和980分别命名为tsuA和tsuB。

五、讨论与结论

该研究通过比较硫饥饿WT与硫充足cymR::Tn的转录组，提供了对CymR调控网络更全面的认识。与先前使用富培养基和微阵列方法的研究相比，本研究采用化学限定培养基和RNA-seq技术，在MRSA USA300 JE2菌株背景下鉴定出更广泛的硫响应基因。铁获取与硫代谢的协调调控对细菌适应宿主环境至关重要，GSH作为低分子量硫醇抗氧化剂，其获取不仅能满足硫需求，还能缓解血红素和H2O2引起的氧化应激，这在溶血性病原体感染过程中具有重要生理意义。不同硫源诱导的转录差异表明金黄色葡萄球菌能够感知并适应局部硫环境。sTS诱导的最大转录变化及TsuAB的鉴定揭示了无机硫利用的独特机制，与E. coli中CysPUWA作为主要TS转运体的模型不同，金黄色葡萄球菌缺乏CysPUWA同源物，而是依赖TsuAB。研究局限性包括单时间点转录组分析，未来研究应关注转运体表达的动态变化及CymR的ChIP-seq分析。总之，该研究提供了丰富的转录组学数据资源，系统揭示了金黄色葡萄球菌在不同硫补充状态下的转录适应机制，深化了对该病原体硫代谢调控网络的理解，为开发针对硫代谢的新型抗菌策略奠定了理论基础。