DdrR在鲍曼不动杆菌中作为DNA损伤诱导的细胞分裂抑制剂

《Journal of Bacteriology》：DdrR acts as a DNA damage-induced cell division inhibitor in Acinetobacter baumannii

　　

鲍曼不动杆菌（Acinetobacter baumannii）属于莫拉菌科（Moraxellaceae），缺乏典型的革兰氏阴性菌DNA损伤应答调控子LexA同源物和细胞分裂抑制因子（cell division inhibitor, CDI）SulA。然而，该菌仍表现出典型的DNA损伤后细胞分裂检查点反应。研究人员发现，一种仅在不动杆菌属中存在的小蛋白DdrR（约71–78个氨基酸），与SOS应答调控因子UmuDAb呈反向转录排列，类似于革兰氏阳性菌中缺乏SulA时的小型CDI蛋白。实验表明，缺失umuDAb导致ddrR过表达的突变株在无DNA损伤条件下即形成丝状体，且在丝裂霉素C（mitomycin C, MMC）处理后细胞长度进一步增加。表达不可切割型UmuDAb A83Y的菌株则未出现上述表型，提示受UmuDAb抑制的基因参与细胞分裂抑制。然而，ΔumuDAb ΔddrR双突变株恢复了野生型细胞长度且不再于DNA损伤后形成丝状体，而ddrR单突变株对MMC的丝状化响应显著弱于野生型。相反，野生型细胞过表达ddrR后在无DNA损伤条件下即发生丝状化。ΔumuDAb突变株因过表达ddrR而表现出倍增时间延长、光密度降低和细胞活力下降等生长缺陷，而这些缺陷可通过敲除ddrR得以恢复。因此，DdrR在鲍曼不动杆菌DNA损伤应答中发挥CDI功能。此项研究的重要性在于，医院环境中的多重耐药机会致病菌鲍曼不动杆菌会因抗生素、紫外线暴露和干燥等因素遭受DNA损伤，从而诱导多个易错聚合酶产生临床相关的抗生素耐药性。尽管该菌缺乏常见的LexA和SulA蛋白，但其DNA损伤应答仍包含典型的细胞分裂检查点机制。研究人员鉴定出小分子SOS蛋白DdrR能够像革兰氏阳性菌的CDI一样抑制细胞分裂：DNA损伤后DdrR是丝状化响应所必需的，而DdrR过表达则会损害细胞生长和活力。揭示这一全新的DNA损伤后生长抑制控制机制，为非肠杆菌科（non-Enterobacteriaceae）革兰氏阴性γ-变形菌纲细菌建立新的细胞分裂抑制模型提供了契机。

研究背景与科学问题

在经典的DNA损伤应答（DNA damage response, DDR）模型中，大肠杆菌（Escherichia coli）和枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）依赖LexA（在芽孢杆菌中称为DinR）阻遏大量SOS基因的表达，其中包括编码SulA等细胞分裂抑制因子（cell division inhibitor, CDI）的基因。SulA通过结合隔膜Z环蛋白FtsZ抑制其聚合，从而阻断细胞分裂。然而，莫拉菌科（Moraxellaceae）的不动杆菌属（Acinetobacter）不仅缺乏lexA和sulA，还拥有非经典的DDR调控网络。鲍曼不动杆菌（Acinetobacter baumannii）作为一种院内感染的多重耐药ESKAPE病原体，能在干燥等环境压力下存活，其DDR中包含强效的SOS诱变响应，可促进抗生素耐药性的产生。已有研究表明，该菌的易错聚合酶由UmuDAb和DdrR共同阻遏，但UmuDAb仅调控约18%的DNA损伤诱导基因，且与LexA的同源性仅有37%。鉴于DdrR分子量小（71–78 AA）、在不动杆菌属外无同源物，且与DDR阻遏蛋白UmuDAb呈反向相邻排列——这一特征与多种缺乏SulA的革兰氏阳性菌的CDI蛋白（如芽孢杆菌的YneA、新月柄杆菌的SidA和金黄色葡萄球菌的SosA）高度相似，研究人员提出假设：DdrR可能在鲍曼不动杆菌DNA损伤后抑制细胞分裂。

主要技术方法

本研究采用的主要关键技术包括：（1）利用自杀载体pEX18Gm进行等位基因替换，构建了鲍曼不动杆菌ATCC 17978的一系列突变株（包括ΔumuDAb、ddrR::TnLK、umuDAb A83Y不可切割突变体、ddrR E14X赭石无义突变体、ΔumuDAb ΔddrR双突变体以及携带C1启动子突变的ddrR1p菌株）；（2）使用阿拉伯糖诱导型表达载体pVRL2构建DdrR和UmuDAb的过表达质粒；（3）通过晶体紫染色后显微成像结合ImageJ插件MicrobeJ定量测量细胞长度；（4）利用BioTek Epoch 2酶标仪连续监测OD₆₀₀以计算倍增时间和生长曲线；（5）通过平板涂布计数CFU/mL评估细胞活力和质量积累。

研究结果

1. umuDAb突变株细胞呈现丝状化并在DNA损伤后进一步伸长

在无DNA损伤条件下，ΔumuDAb突变株细胞较野生型显著伸长，而表达不可切割型UmuDAb A83Y蛋白的菌株细胞长度与野生型无异。经丝裂霉素C（mitomycin C, MMC）处理后，野生型和ΔumuDAb细胞的长度均显著增加，且ΔumuDAb细胞在中部出现膨大现象；但UmuDAb A83Y菌株在DNA损伤后不发生丝状化。这表明受UmuDAb阻遏的某个基因参与了丝状化表型。

2. ΔumuDAb菌株的异常细胞长度在ddrR突变后消失**

由于ΔumuDAb突变株中ddrR表达水平较野生型升高约47倍，研究人员构建了ΔumuDAb ΔddrR双突变株。结果显示，该双突变株的细胞长度恢复至野生型水平，说明ddrR的缺失逆转了ΔumuDAb的细胞伸长表型。

3. 无DNA损伤条件下DdrR过表达导致细胞伸长

在野生型、ddrR::TnLK和ΔumuDAb ΔddrR菌株中，利用pVRL2载体经阿拉伯糖诱导过表达ddrR后，所有菌株的细胞长度均显著增加，且野生型细胞中部出现类似ΔumuDAb的膨大。携带ddrR E14X无义突变的质粒则无法引起细胞伸长，证实该效应依赖于完整的DdrR蛋白。此外，携带C1启动子突变（降低UmuDAb对ddrR-umuDAb操纵子的结合能力）的ddrR1p菌株在无DNA损伤条件下也形成了显著更长的细胞。

4. ddrR突变株无法正常响应DNA损伤而发生丝状化

与野生型相比，ddrR::TnLK插入突变株和ddrR E14X无义突变株在MMC处理后的细胞伸长程度显著减弱。ΔumuDAb ΔddrR双突变株同样不能在MMC处理后伸长，表明ddrR是DNA损伤后丝状化响应的必需基因。相比之下，其他受UmuDAb调控的易错聚合酶基因（umuD A1S_0636和rumB A1S_1173）的缺失并不影响丝状化响应，进一步确认DdrR是唯一的CDI效应因子。

5. DdrR表达改变细胞生长参数

ΔumuDAb菌株（过表达ddrR）的倍增时间（110分钟）显著长于野生型（74分钟）和ddrR::TnLK菌株（67分钟），且在MMC处理后进一步延长至179分钟。ΔumuDAb ΔddrR双突变株的倍增时间恢复至77分钟。ΔumuDAb菌株进入稳定期的时间延迟超过2小时，且终末OD₆₀₀低于其他菌株。相反，ddrR突变株在DNA损伤后进入稳定期的速度比野生型快约20%。

6. DdrR过表达损害菌落形成和细胞质量增长

在90分钟的生长实验中，ΔumuDAb菌株的OD₆₀₀和CFU/mL均显著低于野生型和ddrR::TnLK菌株。即使将CFU/mL按OD₆₀₀标准化后，ΔumuDAb菌株的细胞活力仍然最低。值得注意的是，ddrR::TnLK菌株在MMC处理后的细胞活力（30%）显著低于野生型（48%），而ΔumuDAb菌株的存活率（72%）反而高于野生型，提示DdrR在维持DNA损伤后细胞活力方面具有双重作用。

讨论与结论

本研究表明，鲍曼不动杆菌虽缺乏经典的LexA-SulA通路，但利用小蛋白DdrR作为DNA损伤后的细胞分裂抑制因子。DdrR的分子特征（小尺寸、无跨膜结构域预测、仅存在于不动杆菌属）及其与UmuDAb的反向相邻排列，使其区别于已知的革兰氏阳性菌CDI蛋白（如YneA和SosA）和革兰氏阴性菌的SulA。研究还发现，DdrR可能通过调控细胞分裂相关基因（如advA和aciT）来发挥作用，其中AdvA参与肽聚糖合成和细胞伸长，而AciT是近期鉴定的另一种CDI蛋白。转录组数据显示，DdrR介导了对多个细胞分裂基因的阻遏，包括参与隔膜形成和子细胞分离的必需基因。这些发现揭示了不动杆菌属中独特的DNA损伤后细胞分裂调控机制，为非肠杆菌科革兰氏阴性γ-变形菌纲细菌建立了新的CDI模型。鉴于鲍曼不动杆菌的多重耐药性问题日益严峻，阐明其独特的DDR和细胞分裂抑制机制，有望为开发靶向LexA/DdrR相互作用以增强抗生素疗效的新型治疗策略提供理论基础。该研究发表于《Journal of Bacteriology》。