用于线粒体递送的咪唑基化脂质体的理性设计：从两亲性结构到细胞器特异性靶向

《Colloids and Surfaces B: Biointerfaces》：Rational Design of Imidazolium-Functionalized Liposomes for Mitochondrial Delivery: From Amphiphile Architecture to Organelle-Specific Targeting

　　• 羟丙基咪唑基表面活性剂实现了脂质体的修饰
• 烷基链长度控制着自组装和表面活性剂的行为
• HPIm修饰的脂质体具有良好的稳定性和正电荷
• 靶向线粒体的作用导致ΔΨm下降和caspase-9活性增强
• 装载多柔比星的脂质体提高了疗效并改善了安全性

**引言**
线粒体在细胞代谢、生物能量产生和凋亡调节中起着核心作用，这使得它们成为抗癌治疗和化学预防的理想靶点[1]、[2]。与正常细胞相比，癌细胞表现出显著的线粒体特征，如膜电位升高、氧化呼吸受损、糖酵解增强以及抗氧化防御（如谷胱甘肽GSH）上调。这些变化影响了坏死、自噬和凋亡途径[3]。许多临床使用的抗癌药物会影响线粒体凋亡途径，因此靶向线粒体成为抑制肿瘤细胞增殖的有前景策略。因此，最近有很多研究致力于开发用于定点药物输送的线粒体靶向纳米载体[4]、[5]、[6]、[7]。在纳米级输送系统中，脂质体因具有生物相容性、可降解性以及能够包裹亲水性和疏水性化合物而特别受到关注[8]、[9]、[10]、[11]、[12]。由于其脂质双层结构，脂质体可以保护包裹的药物免受降解并提高细胞摄取[13]。在设计靶向脂质体时，必须考虑与癌细胞相关的几个线粒体参数，包括线粒体膜电位（ΔΨm）、线粒体蛋白、pH值变化、活性氧（ROS）水平升高和GSH增加、线粒体动力学以及己糖激酶2（HK2）的表达增强[2]、[3]。一种靶向线粒体的方法是使用线粒体靶向配体修饰脂质体[14]。这类配体通常具有亲脂性和正电荷两个基本特性。大多数线粒体靶向配体是亲脂性阳离子，其疏水性促进与线粒体膜的相互作用，而正电荷则受负膜电位（-180 mV）驱动在线粒体内积累[15]。典型的这类靶向配体包括三苯基磷酸盐（TPP）[15]、[16]、[17]、脱喹啉[18]、[19]、[20]、吡啶[21]、[22]、Szeto–Schiller四肽家族[23]、[24]、KLA肽[25]、[26]、[27]以及线粒体穿透肽[25]等。TPP阳离子是线粒体靶向的“黄金标准”[29]。早期的方法依赖于将TPP与低分子量药物共价结合，这通常会导致药代动力学和治疗窗口的变化[30]。最近的研究更倾向于将TPP整合到纳米级输送系统中，而不是直接与其结合。Boddapati等人证明，使用TPP修饰脂质体可以在体外和体内通过选择性线粒体积累显著增强鞘氨醇的细胞毒性[31]。随后，这种方法被扩展到聚合物和混合纳米颗粒，实现了如紫杉醇[17]或多柔比星与氯喹[32]的联合输送。特别值得关注的是研究TPP的物理化学性质与纳米载体功能之间的协同作用，例如，将TPP整合到脂质体系统中不仅确保了线粒体靶向，还有助于通过促进药物在负责癌细胞能量代谢的细胞器内积累来克服多重耐药性（MDR）[17]、[33]。此外，将TPP与光敏剂结合可以在线粒体内诱导活性氧的级联释放，为光动力疗法开辟了新的途径[34]、[35]。虽然三苯基磷酸盐（TPP）仍是主要的线粒体靶向配体，但其应用于脂质体系统通常依赖于与脂质、聚合物或治疗分子的共价结合。这种方法通常需要多步骤合成，可能会改变载体或载药的物理化学性质，并且配方优化灵活性有限。相比之下，当前策略依赖于将咪唑基两亲体非共价地直接整合到脂质体双层中。这种自组装驱动的方法消除了化学结合的需要，无需对脂质或包裹药物进行共价修饰。此外，咪唑基骨架在结构上非常灵活：极性头基团和疏水链都可以系统地进行修饰，从而无需重新设计整个输送系统即可直接调整膜相互作用、胶体稳定性和表面电荷及生物性能。然而，与TPP不同，咪唑基阳离子的线粒体靶向行为记录较少。尽管电荷离域表明基于咪唑基的两亲体可能作为线粒体载体发挥作用，但直接实验证据仍然有限。我们最近对TPP修饰和咪唑基修饰脂质体的比较研究表明，这两种系统在细胞系中的线粒体共定位存在差异[36]、[37]。因此，扩展可用的线粒体导向基序范围仍是纳米医学中的一个重要目标。咪唑环也存在于生物重要性分子中，包括组氨酸和嘌呤核碱基。这种结构关系为研究纳米载体中的咪唑基基序提供了额外的动力，尽管它们的生物相容性和生物相互作用需要通过实验来验证。在我们之前的研究中，我们提出并详细研究了一种使用阳离子表面活性剂非共价修饰脂质层来创建线粒体靶向脂质体的方法[16]、[36]、[37]、[38]、[39]。使用了携带三苯基磷酸盐和咪唑基头基团的两亲体作为修饰剂。结果显示，这两种修饰都提供了高脂质体稳定性（>4个月）、显著的正电荷，以及有效包裹亲水性多柔比星盐酸盐和疏水性鱼藤酮[36]、[37]。修饰后的脂质体显示出高细胞内化率。一个关键发现是，不仅三苯基磷酸盐阳离子，而且咪唑基阳离子也能有效地确保纳米载体与线粒体的共定位（根据共聚焦显微镜数据，相关系数明显高于未修饰的脂质体）。这些TPP和咪唑基阳离子的比较研究表明，根据细胞系的不同，可以观察到磷酸盐修饰或咪唑基修饰的脂质体与线粒体的优先共定位[36]、[37]。因此，扩展线粒体载体的范围是纳米医学中的一个紧迫挑战。最近的研究进一步表明，线粒体定位不仅限于经典的亲脂性阳离子。例如，一种非离子性的空间受阻酚-氨基吡啶模块实现了荧光复合物在线粒体和内质网中的协同定位，展示了结构和物理化学特征的模块化组合如何产生靶向细胞器的行为[40]。此外，将线粒体靶向脂质体与损害线粒体功能的物质（如多柔比星、鱼藤酮）结合，提高了抗癌治疗的选择性，这反映在肿瘤细胞的选择性指数（SI）上比游离药物更高[36]、[37]。尽管已经研究了烷基链长度对许多两亲体系自组装和物理化学性质的影响，但系统性地修饰头基团的后果尚未得到充分探索。我们最近的综述[11]总结了烷基链长度和头基团结构如何影响咪唑基表面活性剂的性质，包括它们的形态和溶解能力。本研究将这些研究扩展到了HPIm-n同系物（HPIm-12、HPIm-14、HPIm-16和HPIm-18），这些同系物之前尚未作为一个非共价修饰剂家族进行系统评估。据我们所知，这是首次将这些羟丙基修饰的咪唑基两亲体进行综合评估，将表面活性剂自组装和生物活性与脂质体工程、细胞摄取、线粒体相关定位、凋亡相关反应以及多柔比星载药制剂的性能连接在一个共同的结构-性质-功能框架内。在本研究中，我们试图建立基于咪唑基修饰脂质体的多功能线粒体导向药物输送平台的设计原则。我们合成了具有系统变化烷基链长度（HPIm-n，n = 12、14、16和18；图1）的羟丙基取代咪唑基表面活性剂，并评估了它们的分子结构如何影响自组装、生物活性和脂质体性能。然后使用这些表面活性剂作为脂质体纳米载体的非共价修饰剂。引入羟丙基取代基是为了研究亲水段的修饰是否会影响亲水-疏水平衡，从而影响两亲体的物理化学和生物行为。我们假设这种修饰可以在保持咪唑基两亲体膜亲和力的同时影响胶体行为和生物性能。通过系统地变化烷基链和共同的羟丙基修饰头基团，我们建立了表面活性剂结构、自组装、脂质体性质和生物活性之间的关系。本研究并未直接确定氢键或亲水-疏水平衡对线粒体相关定位的贡献。因此，这些因素应被视为HPIm-n同系物行为的可能影响因素，而不是实验已证实的机制[41]、[42]、[43]。这里报告的系统表征为定义表面活性剂结构-性质-功能关系提供了基础，但进一步的机制研究将有助于确定其分子起源。