微弧氧化Ti–2.5Ag合金的表面表征及其对牙龈卟啉单胞菌（Porphyromonas gingivalis）的增强抗菌活性：表面物理化学性质与可控银离子释放的作用
《Colloids and Surfaces B: Biointerfaces》：Surface Characterization and Enhanced Antibacterial Activity of Micro-Arc Oxidized Ti–2.5Ag Alloy Against
Porphyromonas gingivalis: Role of Surface Physicochemistry and Controlled Ag? Release
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•通过微弧氧化（MAO）处理Ti–2.5Ag合金，能够获得具有增强粗糙度和亲水性的微孔TiO?层。•MAO处理后的多孔结构能够维持7天内的亚细胞毒性Ag?多相位释放。•尽管亲水性增强，MAO+Ag表面仍能减少Porphyromonas gingivalis生物膜的形成。•蛋白质泄
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通过微弧氧化（MAO）处理Ti–2.5Ag合金，能够获得具有增强粗糙度和亲水性的微孔TiO?层。
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MAO处理后的多孔结构能够维持7天内的亚细胞毒性Ag?多相位释放。
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尽管亲水性增强，MAO+Ag表面仍能减少Porphyromonas gingivalis生物膜的形成。
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蛋白质泄漏现象证实了Ag?对膜结构的破坏是杀菌机制。
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Ti–2.5Ag + MAO组合具有良好的双重抗感染性能，并且表面安全，适合与骨结合。
引言
基于钛（Ti）的植入物由于其机械性能、抗腐蚀性和生物相容性，已成为牙科和骨科手术的金标准[1]。然而，长期临床应用仍面临两个相互关联的问题：骨整合效果不佳以及植入物表面容易受到细菌定植和生物膜形成的影响[2],[3],[4]，因为植入物周围的感染会直接干扰骨骼整合所需的生物过程，最终导致植入物失败和需要重新手术[3],[4]。常规处理方法如喷砂和酸蚀虽然可以改善表面形态并促进早期骨整合，但无法提供抗菌功能[2]。天然TiO?被动层具有生物惰性，缺乏促进骨形成的能力或抗菌活性[5]，这使得未经改性的钛在复杂的口腔环境中容易被细菌附着。一旦细菌附着，就会形成对抗生素和宿主防御机制具有高度抵抗力的生物膜[6]。在其中，Porphyromonas gingivalis是一种关键的厌氧革兰氏阴性病原体，它具有强烈的附着能力，能够形成耐抗生素的生物膜，并侵入宿主组织，逃避免疫系统清除[7],[8],[9],[10]，与植入物周围炎症、慢性牙周炎和进行性骨吸收有密切关联，因此它是评估改良植入物表面的理想模型生物[9],[10],[11],[12],[13]。由于没有策略能够完全清除生物膜，因此抑制细菌的早期附着和生物膜成熟成为最合理的预防方法[6]。这使得人们越来越关注含有抗菌成分的钛合金（如银、铜、锌），这些合金的抗菌效果来源于金属离子的持续释放，可以同时在多个靶点上干扰细菌功能[14]。在这些金属中，铜和锌因其较低的细胞毒性以及作为哺乳动物生理必需微量元素的作用而受到重视，多项研究表明含铜或锌的MAO涂层具有良好的抗菌和生物相容性[15],[16]。同时，通过MAO处理制造的Ca-P盐和含铜涂层也广泛用于提高钛合金的生物活性或赋予其抗菌功能[15],[16],[17]。然而，本研究选择了银，因为银在较低的有效浓度下就具有广谱杀菌作用，这大大减少了对实现临床效果所需的离子负荷[18],[19],[20]。
银因其低浓度下的广谱杀菌作用、明确的亚细胞毒性安全性以及多种协同杀菌机制（包括破坏细胞膜、干扰酶活性和信号传导、ROS介导的氧化损伤以及抑制生物膜形成）而备受关注，这些机制相对于传统抗生素而言，更难以使细菌产生抗性[21],[22],[23],[24],[25]；此外，银的抗炎特性还有助于促进植入物周围的愈合[26]。一个关键挑战是在保持抗菌效果的同时兼顾生物相容性，因为治疗所需的Ag?浓度可能会对成骨细胞造成毒性并导致系统性的银积累[14]，而可控的亚细胞毒性释放则可以促进成骨细胞的分化和基质的沉积[27]。需要注意的是，仅合金中的银含量并不能决定抗菌效果：含有高达20%银的Ti–Ag锭显示出不一致的抗菌活性，而烧结后的Ti–3%银合金对金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）的抑制率可达到98.2%[28],[29],[30]，这表明表面银的物理化学状态、分布和释放动力学与其总量同样重要甚至更为重要[30]。
因此，要实现可控且持续的Ag?释放，需要一种具有明确孔隙结构、化学稳定性和良好表面能的载体。微弧氧化（MAO，也称为等离子电解氧化）非常适合这一目的[31],[32],[33]：在含水电解质中对钛施加高阳极电压，会产生局部的等离子体放电，形成致密、附着性强、多孔的TiO?基氧化物层，其组成、相结构和表面形态可以通过电解质化学性质和工艺参数来调节[34],[35]。这种多孔结构作为持续释放抗菌离子的储存库[36]，同时还能提高表面的粗糙度和亲水性，从而促进蛋白质吸附、成骨细胞附着和分化[37],[38]；电解质中含有的磷和硅成分进一步增强了生物活性[39]。将MAO与银结合使用是一种合理的双重功能策略。含硅的电解质也已在MAO处理中得到广泛应用，因为硅被认为是一种可以提升钛表面生物活性的元素。将硅酸盐成分纳入MAO涂层有助于促进羟基磷灰石的生成，提高涂层的稳定性，并为骨形成提供有利的化学环境。因此，本研究中选择了Na?SiO?作为MAO电解质中的硅来源，旨在将硅元素引入TiO?基涂层中，以协同增强改性的表面性能，同时保持控制Ag?释放所需的多孔结构[38],[39],[40]。
尽管MAO和银单独使用都具有各自的优点，但它们共同作用于钛的物理化学性质和对抗临床相关厌氧口腔病原体的抗菌效果的研究还不够充分，特别是关于MAO诱导的孔隙结构、表面能、相组成以及元素掺入如何调节低银含量合金中的Ag?释放动力学。大多数现有研究集中在好氧菌如金黄色葡萄球菌（S. aureus）和大肠杆菌（E. coli）上。虽然已有研究评估了含有铜、锌或镁等抗菌元素的MAO涂层对Porphyromonas gingivalis的效果[5],[10],[11]，但目前尚无研究表明低银含量（2.5%）的Ti–Ag合金与MAO结合处理对该关键厌氧病原体的效果，以及这种处理如何与蛋白质泄漏所证实的膜结构破坏和七天内的多相位Ag?释放动力学相结合。
为了解决这一难题，本研究制备了三种表面形态：CP-Ti（参考对照组）、Ti–2.5Ag合金（Ti+Ag）和经过MAO处理的Ti–2.5Ag（Ti+Ag+MAO），并利用SEM/EDS、XRD、XPS、表面轮廓测量和水接触角测量对其进行了全面表征。通过ICP-MS量化了七天内的Ag?释放动力学，并通过CFU计数（浮游和附着菌）、活/死菌荧光染色、结晶紫生物膜定量、SEM细菌形态观察和蛋白质泄漏检测等方法评估了其对Porphyromonas gingivalis的抗菌和抗生物膜效果。我们假设MAO处理可以通过形成含有电解质来源的磷和硅的稳定多孔TiO?层来增强表面的粗糙度和亲水性，并控制Ag?的释放，从而协同提升Ti–2.5Ag合金对Porphyromonas gingivalis的抗菌和抗生物膜效果，超越单独使用任何一种改性的效果。
章节摘要
样品制备和灭菌
实验使用了高纯度钛海绵（99.99%）和纯银（99.99%）（上海Aladdin生化科技有限公司，中国上海）。Ti–2.5Ag合金（含2.5%银）是通过高真空消耗电弧熔炉熔炼制成的（重复熔炼≥6次以确保均匀性），然后切割成直径15毫米、厚度1毫米的圆盘，并用江苏 shitai 实验设备有限公司提供的100#、400#、800#、2000#碳化硅砂纸进行抛光。
表面形态
扫描电子显微镜（SEM）分析（图1）显示三组样品之间存在明显的形态差异。CP-Ti表面相对光滑，有可见的抛光痕迹，没有明显的孔洞。Ti+Ag的表面形态与CP-Ti相似，表明银的掺入并未显著改变表面纹理。相比之下，Ti+Ag+MAO的表面粗糙且多孔，孔洞分布均匀，证实成功形成了具有显著增加粗糙度的多孔氧化物层。
讨论
本研究探讨了银掺入和微弧氧化对钛材料物理化学性质及抗菌性能的影响，特别是其对Porphyromonas gingivalis的作用。MAO处理显著改变了Ti–2.5Ag合金的表面，形成了具有增强粗糙度和亲水性的微孔TiO?层，并实现了可控的Ag?释放，从而提升了整体的抗菌和抗生物膜效果。
结论
本研究表明，MAO表面处理显著提升了Ti–2.5Ag合金的物理化学性质和抗菌性能。MAO生成了含有电解质来源的磷和硅的微孔TiO?层，显著提高了表面粗糙度和亲水性，同时实现了亚细胞毒性浓度下的持续多相位Ag?释放。Ti+Ag+MAO表面表现出更强的抗菌和抗生物膜效果。
吴琳：数据可视化、验证、监督、项目管理、资金获取。曹红娟：数据可视化。Hanan Al-Fakeh：初稿撰写、软件使用、资源准备、项目管理、方法设计、实验实施、资金获取、数据分析、概念构思。郑楠楠：验证、实验实施。Hasan M. Sharhan：论文撰写与修订、方法设计、实验实施、数据分析、概念构思。
作者声明不存在可能影响本文研究的已知财务利益或个人关系。
作者声明不存在可能影响本文研究的已知财务利益或个人关系。
Hanan Al-Fakeh|Hasan M. Sharhan|Zheng Nan Nan|Cao Hong Juan|Wu Lin
