病毒特异性T细胞和中和抗体是丙型肝炎病毒长期保护性免疫的独立相关因素

《Journal of Virology》：Virus-specific T cells and neutralizing antibodies are independent correlates of long-term protective immunity against hepatitis C virus

　　

病毒特异性T细胞和广谱中和抗体（NAbs）与急性初次丙型肝炎病毒（HCV）感染及再感染的自发清除相关。自发清除后，HCV特异性记忆T细胞长期存在，但NAbs持久性较差。这两种免疫臂在再次暴露时对长期保护性免疫的贡献尚不清楚。本研究比较了一个HCV自发清除且存在高危病毒暴露但未观察到再感染的注射吸毒者队列（FOR，n=34）与发生再感染队列（n=22）中记忆性HCV特异性T细胞和NAbs的幅度与广度。在FOR中，73.5%（n=25）表现出高频率的γ干扰素（IFN-γ）产生T细胞，而23.5%（n=8）表现出高中和广度（对HCV假颗粒[HCVpp]的中和>25%）和/或效价（针对七种HCVpp的几何平均中和>50%）。值得注意的是，一些受试者在清除后数年内仍可检出NAbs。多变量随机森林分析表明，IFN-γ产生T细胞的频率以及仅针对一种难以中和的HCVpp（1b58）的NAb应答是再感染保护性的显著预测因子（P<0.05）。对具有多次感染发作受试者免疫应答的纵向分析显示，强且广的HCV特异性T细胞应答与自发清除发作相关。相反，在缺乏记忆T细胞的情况下，或若因既往发作毒株的免疫印记而无法识别感染病毒，NAbs并不能在再次暴露时防止慢性化。总之，T细胞应答和针对特定分离株的NAbs是HCV长期保护性免疫的独立预测因子。

重要性：丙型肝炎病毒（HCV）是一种血源性病毒，对注射吸毒者影响尤为严重。大多数HCV感染会持续存在，导致肝纤维化和癌症。尽管有有效抗病毒治疗，仍有约5000万人持续感染HCV并可传播病毒。目前尚无疫苗控制HCV传播。然而，大约四分之一感染者能自然清除病毒，再次暴露时获得部分保护，表明有可能开发诱导类似保护的疫苗。在本研究中，研究人员调查了在自然清除HCV但仍处于高危暴露的注射吸毒者队列中，T细胞和中和抗体对避免观察到再感染的保护贡献。研究结果表明，强T细胞应答和针对难以中和分离株的中和抗体可预测再感染时的保护性免疫。

该研究发表于《Journal of Virology》，关注丙型肝炎病毒（HCV）再感染中的长期保护性免疫机制。HCV感染约25%可自发清除，其余发展为慢性感染，可导致肝纤维化和肝癌。有效直接作用抗病毒药物（DAA）虽已问世，但感染无症状、高危人群筛查和治疗可及性有限，加之阿片类药物流行，新发感染和再感染仍持续发生。注射吸毒者（PWID）自发清除后再次暴露的再感染率仍高；但曾自发清除者再次清除的可能性是初感者的12倍，约80%的二次感染可自发清除，提示存在长期保护性免疫。病毒特异性CD4⁺和CD8⁺ T细胞对急性感染清除至关重要，中和抗体（NAbs）也与清除相关，但两者在长期保护中的相对贡献尚不清楚。目前尚无HCV疫苗；首个进入临床试验的T细胞疫苗未能预防慢性感染，仅降低病毒载量。因此，明确T细胞和NAbs各自在长期保护中的角色对疫苗设计至关重要。

研究人员依托蒙特利尔丙型肝炎队列，纳入56名自发清除初次HCV感染的PWID，根据随访期间是否观察到再感染，分为未观察到再感染组（free of observed reinfection, FOR，n=34）和再感染组（R，n=22），并按清除后时间<2年或≥2年分层。所有受试者均有高危注射暴露史，两组的注射次数相当。关键技术方法包括：用γ干扰素（IFN-γ）酶联免疫斑点（ELISpot）检测外周血单个核细胞（PBMCs）对覆盖HCV全多蛋白肽库的T细胞应答；用HCV假颗粒（HCVpp）中和试验评估血浆NAb的广度和效价；用ELISA检测抗E2和抗NS3抗体；对HLA-B27阳性者用四聚体和激活诱导标志物（AIM）试验评估CD8⁺ T细胞表位识别；并用多变量随机森林模型分析保护性预测因素。样本队列来源为加拿大蒙特利尔丙型肝炎队列，受试者为有高危注射行为的PWID。

研究结果如下。

队列特征和研究时间点：56名自发清除者中，FOR为34人，R为22人。长期暴露（≥2年）组的随访间隔较长，但两组注射次数等暴露风险相当，且自发清除率在R组中为63.6%，与既往报道一致。

长期HCV暴露且未观察到再感染的PWID具有更强的HCV中和活性：研究人员比较了血浆对七种不同中和敏感度HCVpp（tier 1–4）的中和活性。FOR与R组间中和广度（>25%中和的HCVpp数量）和效价（七种HCVpp中和百分比的几何均值）无显著总体差异，但长期暴露（≥2年）者的中和效价显著高于短期暴露者；在FOR中，中和广度、效价均与清除后时间呈正相关。这表明部分长期暴露者可维持数年的血浆中和活性。

在暴露且未观察到再感染的PWID中，HCV特异性T细胞长期存在、广谱且高频：IFN-γ ELISpot结果显示，FOR组HCV特异性T细胞频率显著高于R组；清除≥2年的FOR组T细胞广度（靶向HCV蛋白数）显著高于清除<2年的FOR组，也高于长期暴露的R组。一例受试者在清除24年后仍可检出HCV特异性T细胞应答，说明记忆T细胞可长期维持。T细胞应答与NAb的中和广度或效价不相关，提示两种免疫应答彼此独立。

注射频率与中和活性相关，但与HCV特异性T细胞应答无关：报告每月≥30次注射的受试者中和广度与效价显著更高，但HCV特异性T细胞频率无差异，且与是否再感染无关。这说明高频暴露可能增强NAb，但这种增强并不直接转化为再感染保护。

IFN-γ T细胞应答幅度是暴露PWID中保护性的显著预测因子：多变量随机森林分析纳入各HCVpp中和值、T细胞应答幅度与广度、注射次数、IFNL4基因型和性别等变量。结果显示，仅针对1b58 HCVpp（一种tier 3难以中和毒株）的中和活性，以及IFN-γ产生T细胞频率，是区分FOR与R组的显著预测因子；总体中和广度与效价并非显著预测指标。这表明特异性识别难中和毒株的抗体和强T细胞应答是更优的保护相关因素。

在缺乏HCV特异性T细胞应答时，NAbs可能无法在后续HCV感染发作中提供保护：对多次感染个体的纵向分析显示，Subject 1三次感染均自发清除，其T细胞频率高但NAb反应弱；Subject 2前两次清除、第三次转为慢性感染，其NAb广度和效价高但T细胞应答弱。该结果提示，在缺乏有效记忆T细胞的情况下，即使存在较强NAb也可能无法防止慢性化。

CD8⁺ T细胞表位识别受损和晚期NAbs不能防止持续性HCV再感染：Subject 3前两次清除、第三次感染基因3a后慢性化。尽管该受试者为HLA-B27⁺，并能检出针对NS5B_2841–2849表位的四聚体阳性CD8⁺ T细胞，但基因3a表位序列变异导致AIM试验中CD8⁺ T细胞激活显著下降。NAbs在第三次感染中出现较晚，且偏向基因1a，提示免疫印记可能限制了对感染毒株的识别。表位识别受损与记忆T细胞激活不足共同参与了慢性感染的建立。

讨论部分指出，NAbs通常在自发清除后短期存在，而T细胞应答可持续数十年；本研究中NAb随清除后时间延长而增加，可能由高危暴露造成的亚临床感染或记忆B细胞再激活所致。虽然总体NAb广度/效价不能区分FOR与R，但针对单个难中和毒株的中和可预测保护，提示抗体表位质量比总体广度更重要。T细胞与NAb无相关性支持二者为独立保护因素。CD8⁺ T细胞表位逃逸可导致慢性化，疫苗抗原应选择保守区域或合适基因型以诱导交叉反应。研究局限包括样本量较小、队列以男性为主、依赖自我报告注射频率，以及部分受试者入组时可能已有多次清除史。

研究结论为：T细胞应答与NAbs以不同程度独立贡献于HCV长期保护性免疫。病毒和宿主相关因素决定免疫平衡偏向强T细胞应答或NAb应答；部分情况下单一应答可能足够，但大多数人需要两者联合。下一代疫苗应同时靶向T细胞和NAb。鉴于目前缺少HCV疫苗，高危人群包括DAA治愈者仍面临再感染风险，且DAA治疗不能完全重建功能性T细胞和B细胞应答；未来需在DAA治愈后再次感染者中寻找免疫保护相关因素。