《Journal of Virology》：Spike protein derived from an apathogenic IBV strain confers attenuated phenotype to a nephropathogenic IBV strain
编辑推荐：
传染性支气管炎病毒（infectious bronchitis virus，IBV）作为一种γ冠状病毒（Gammacoronavirus），可引发家禽传染性支气管炎，造成重大经济损失。IBV减毒活疫苗（live attenuated vaccines，LAVs
传染性支气管炎病毒（infectious bronchitis virus，IBV）作为一种γ冠状病毒（Gammacoronavirus），可引发家禽传染性支气管炎，造成重大经济损失。IBV减毒活疫苗（live attenuated vaccines，LAVs）的研发依赖于鸡胚供应，并需通过多达80次以上的连续传代实现减毒。疫苗开发需与IBV的进化保持同步；而各IBV血清型之间交叉保护作用难以预测且通常有限，这一问题进一步加剧了研发难度。理性减毒策略与LAVs在细胞培养中增殖能力的结合，在适应性、成本及速度方面具有显著优势。大多数田间IBV毒株表现出受限的体外（in vitro）嗜性，未经连续传代和适应则无法在原代或传代细胞中复制。减毒IBV毒株Beaudette能够在Vero细胞中复制，该能力由刺突（spike，S）糖蛋白赋予。本研究利用基于嗜肾性IBV毒株D388的重组IBV（recombinant IBV，rIBV），将其S序列替换为源自Beaudette的相应序列，确定了Beaudette刺突蛋白能够赋予远缘相关IBV毒株在Vero细胞中复制的能力以及Beaudette相关的体内（in vivo）减毒表型。对感染性子代病毒及体内病毒RNA的评估表明，减毒是通过一种不依赖于组织嗜性的分子机制实现的。先天免疫应答分析显示，该重组病毒诱导的免疫应答强度较低且炎症特征较轻。本研究结果支持将Beaudette S蛋白作为开发理性减毒、可在细胞培养中增殖的rIBV疫苗的途径，并确定S蛋白是嗜肾致病性的一个贡献因素。
论文解读：Beaudette刺突蛋白赋予嗜肾性IBV毒株减毒表型的研究
一、研究背景与意义
传染性支气管炎病毒（infectious bronchitis virus，IBV）属于γ冠状病毒（Gammacoronavirus），是引起家禽传染性支气管炎（infectious bronchitis，IB）的病原体，给全球养禽业造成严重经济损失。感染鸡只表现为打喷嚏、啰音、鼻腔分泌物、流泪、嗜睡、体重增长减缓，产蛋鸡产蛋量和蛋品质下降。部分IBV毒株感染可导致严重全身性疾病，包括肾炎，这类毒株被称为嗜肾性毒株（nephropathogenic strains）。近40年来，多个嗜肾性毒株在全球多地流行，包括1984年出现的B1648、1998年的QX以及2000年代前后的Variant 2等。嗜肾致病性的分子机制尚不清楚，但过度刺激炎症通路和细胞因子表达（如NLRP3炎症小体、IL-1B、IL-18和NF-κβ）被认为与此相关，目前尚未确定任何特定病毒基因与嗜肾致病性直接相关。
当前IBV的控制主要依靠生物安全措施和疫苗接种，以减毒活疫苗（live attenuated vaccines，LAVs）为主。LAVs通过在SPF鸡胚中连续传代（通常80-100次）获得，这一过程耗时且完全依赖SPF鸡胚供应。传代过程中产生的遗传变化不可预测，减毒程度不一，且过传代可能损害疫苗效力。此外，由于获得的一致性突变较少，存在通过突变或与田间毒株重组而恢复毒力的短分子途径。更关键的是，LAVs在不同血清型IBV毒株间交叉保护作用有限，而IBV通过遗传漂变和/或重组持续进化，疫苗研发难以跟上新出现毒株的步伐。因此，开发能够快速响应新变异株、不依赖鸡胚供应、可在细胞培养中生产的理性减毒疫苗具有重大意义。
Vero细胞是广泛用于多种疫苗生产的连续细胞系，但通常不允许IBV感染。减毒的Beaudette毒株是例外，能够在Vero细胞中复制，此前研究已证实该能力由S蛋白赋予。Beaudette毒株免疫原性差、体内嗜性高度受限，不适合直接作为LAV使用，但其S蛋白具有双重应用价值：既可赋予异源毒株在Vero细胞中复制的能力，又可传递减毒表型。此前研究已在M41毒株（GI-1基因型）骨架上验证了这一策略，M41-Beau(S)重组病毒免疫后可提供对强毒M41攻击的100%保护。然而，M41与Beaudette同属GI-1基因型，S蛋白氨基酸同源性达95%，Beaudette S蛋白能否作为通用减毒方法应用于远缘相关毒株尚属未知。本研究选用与Beaudette S蛋白氨基酸同源性仅82%的嗜肾性D388毒株（GI-19基因型，QX血清型），旨在回答这一问题。
二、主要技术方法
研究人员采用了多种关键技术方法开展本研究。反向遗传学方面，利用基于Golden Gate组装的反向遗传学系统构建了重组病毒D388-Beau(S)，将D388 S基因胞外域（核苷酸20376-23607）替换为Beaudette分子克隆Beau-R的相应序列（核苷酸20418-23640），同时保留D388的信号序列、跨膜结构域和胞质尾序列。病毒复制评估涉及多种系统：10-11日龄SPF鸡胚体内（in ovo）感染、离体气管器官培养（tracheal organ cultures，TOCs）、原代鸡肾（chicken kidney，CK）细胞、Vero细胞和DF1细胞。病毒定量采用CK细胞空斑试验和TOCs半数纤毛静止剂量（CD50）滴定法。遗传稳定性评估通过鸡胚连续传代5代后进行Sanger测序。体内致病性实验使用8日龄SPF罗德岛红（RIR）鸡，每组15只，通过眼鼻途径接种104 PFU病毒，每日监测打喷嚏和啰音等临床症状，并在感染后第4天和第6天每组随机处死5只鸡，采集眼睑、气管、肺、肾和法氏囊组织。病毒RNA定量采用针对5′UTR和N亚基因组mRNA（sgmRNA）的RT-qPCR。组织来源病毒RNA通过Illumina探针富集测序进行全基因组分析。先天免疫应答分析采用96.96 IFC Fluidigm动态阵列qPCR技术，检测多个免疫相关基因的表达变化。
三、研究结果
D388与Beaudette的S蛋白序列差异处于中等水平
研究人员从NCBI下载了868条IBV全长基因组序列，与Beaudette序列比对后计算S蛋白氨基酸同源性，范围为63.4%至100%，多数序列集中于中位数82.7%。D388与Beaudette的S蛋白氨基酸同源性为82%，相当于209个氨基酸差异（S1亚基129个，S2亚基80个），代表了IBV S蛋白观察到的中等多样性水平。全基因组比较显示，两毒株各蛋白氨基酸同源性从55%到98%不等，其中辅助蛋白差异最大，Beaudette在4b、4c和7蛋白上存在大段截短。
D388-Beau(S)重组病毒的构建
利用Golden Gate组装反向遗传学系统构建了D388-Beau(S)重组病毒。该病毒的S基因为嵌合型，胞外域来自Beaudette，而信号序列、跨膜结构域和胞质尾序列保留D388来源，以保持nsp16序列完整性并维持与其他D388蛋白的相互作用。Illumina下一代测序确认了病毒序列符合预期，覆盖率98.6%，平均读深46,000。
D388-Beau(S)表现出与Beau-R相似的复制动力学
在鸡胚和离体气管器官培养中，D388-Beau(S)与Beau-R的感染性病毒滴度相似，均显著低于亲本毒株D388-R。在原代CK细胞中，D388-Beau(S)与Beau-R在96小时内的复制动力学相当，空斑形态和直径也相似。在DF1和Vero连续细胞系中，D388-Beau(S)的复制模式与Beau-R相似，但滴度在24至96小时期间较低。亲本毒株D388-R无法在体外有效复制。S基因替换使D388-Beau(S)获得了体外复制能力，证明Beaudette S蛋白能够将嗜性赋予远缘IBV基因组骨架。
Beaudette S基因在鸡胚传代过程中遗传稳定
将D388-Beau(S)与Beau-R和D388-R一起在鸡胚中连续传代5代，三个独立重复均未在S基因中检测到任何突变，表明D388-Beau(S)的S基因遗传稳定。
感染D388-Beau(S)的鸡只临床症状减轻
体内致病性实验中，D388-Beau(S)感染组的打喷嚏水平远低于D388-R组，更接近模拟感染组，且该组无鸡只出现啰音。D388-R感染组在感染后第3至11天表现出高水平打喷嚏，第6天达峰值；啰音在第3至12天观察到，第4、6、7天阳性率最高达60%。D388-R组有两只鸡在第13天达到人道终点被安乐死，D388-Beau(S)组无鸡只达到人道终点。
D388-Beau(S)表现出减毒体内表型
感染后第4天和第6天，D388-R感染组气管纤毛活动完全停止（纤毛静止），而D388-Beau(S)组气管纤毛活动范围为40%-98%，大多数鸡只（第4天3/5，第6天4/5）与模拟感染组相当。结合临床症状的缺失，表明D388-Beau(S)在体内表现出减毒表型。
D388-Beau(S)的体内组织嗜性与致病性对照D388-R相当
在眼睑、气管、肺、肾和法氏囊组织中均检测到D388-Beau(S)和D388-R的病毒RNA和感染性病毒，表明两病毒的组织嗜性相当。D388-Beau(S)在肺、肾和法氏囊中的基因组RNA和N sgmRNA水平与D388-R相当，在眼睑（第4天）和气管（第6天）中较低。所有组织中D388-Beau(S)的感染性病毒滴度均低于D388-R。感染性病毒和病毒RNA在相似组织中的存在表明，D388-Beau(S)的减毒表型是通过不依赖组织嗜性的分子机制实现的。
体内嗜性并非D388-Beau(S)序列变化的结果
对感染后第6天肾组织来源RNA进行Illumina测序，D388-R序列未发现非同义突变，仅一条序列含有一个同义点突变A25500T。D388-Beau(S)三条序列中，一条含nsp14同义突变C18521T，一条含S基因非同义突变T20579G（导致S1-NTD的I52S），该突变仅存在于37%的读段中。未发现可解释组织嗜性差异的序列变化。
气管中D388-Beau(S)引发的先天免疫应答功能多样且在第6天消退
主成分分析显示气管样本按感染状态聚类。第4天，两病毒感染诱导27个共享上调基因，涉及干扰素通路（ISG12-2、IFIT5）、细胞因子信号（CXCLi1、IFNG、IL4I1、CXCL13L2、CD8b）和病原体感知功能。D388-R感染与7个独有调控基因相关，而D388-Beau(S)诱导更广泛的毒株特异性谱，包括干扰素信号介质（TRIM25、IFITM5、GBP、MYD88、IRF10、IRF7）和模式识别受体（ZAP、TLR7、PKR）的上调。第6天，转录应答主要与D388-R感染相关，47个显著差异表达基因中45个为D388-R特异性，仅IFNG和CXCLi1为两毒株共同调控，D388-R感染鸡中表达更高。D388-Beau(S)在该时间点无特异性差异表达基因。
肾脏中D388-R引发的先天免疫应答较D388-Beau(S)更具促炎性和抗微生物性
肾脏中，第4天转录应答偏向D388-R感染，17个基因共享，47个为D388-R独有。共享应答包括OASL和典型ISGs（IFIT5、ISG12-2、MX1）的上调。D388-R感染与三个干扰素调控和ISG转录本的显著上调相关。第6天，两毒株间应答趋于相似，31个基因共同调控，毒株特异性差异表达基因较少（D388-Beau(S)八个，D388-R七个）。共享ISGs（ISG12-2、OASL、MX1、IFIT5）在两毒株中均高表达。D388-Beau(S)感染显示模式识别受体（TLR7、TLR3、PKR）和细胞因子相关基因（IL22RA2、IL17REL、IL15）表达增加，而D388-R感染与额外ISGs（TRIM29、GBP）、促炎介质（IL6、IFNG）和禽β-防御素-2的表达增加相关。
四、讨论与结论
本研究表明，来自实验室适应毒株Beaudette的S基因能够将减毒体内表型和Vero细胞复制能力赋予远缘相关的高致病性IBV毒株D388。异源S糖蛋白的存在未对病毒复制产生负面影响，连续传代中未观察到明显的补偿性突变。D388-Beau(S)在Vero细胞中的滴度虽低于Beau-R（平均低两个数量级），但不太可能是Beaudette S与D388骨架序列不相容所致，因为在原代CK细胞中两病毒复制相当，表明Beaudette S糖蛋白能够实现完全的嗜性转换，S基因以外的序列差异更可能解释总体复制差异。
D388-Beau(S)表现出减毒体内表型，临床症状减少、气管纤毛活动保留。此前研究表明，将致病性4/91毒株的S基因（与M41 S蛋白氨基酸同源性81.7%）替换至致病性M41骨架中，所得重组病毒仍具致病性，说明D388-Beau(S)观察到的减毒表型可特异性归因于Beaudette S糖蛋白的存在。这进一步支持S糖蛋白是IBV的致病性因子，与其他冠状病毒（如TGEV、MHV和SARS-CoV-2）的研究一致。但需注意，在Beaudette或H120疫苗株骨架中替换致病性毒株的S序列并不能赋予致病表型，表明S对致病性的贡献依赖于其基因组背景。
D388-Beau(S)表现出与嗜肾性D388-R相当的组织嗜性，感染性病毒和病毒RNA均从原发和继发复制位点组织中分离到，表明Beaudette感染中观察到的受限嗜性并非单纯由S糖蛋白介导，Beaudette S赋予的减毒是通过不依赖组织嗜性的分子机制实现的。这一发现表明组织嗜性与致病性并非直接关联，嗜肾致病性并非仅由IBV在肾脏中复制的能力决定。通过将D388 S糖蛋白替换为非嗜肾性减毒毒株的S序列，本研究将S蛋白确定为嗜肾致病性的一个贡献因素。
转录分析显示，D388-R感染与持续、强烈的先天免疫激活相关，表现为干扰素刺激基因、炎症细胞因子和抗微生物效应物的持续上调，而D388-Beau(S)感染的特征是更广泛但更短暂和受调控的应答。由于两病毒的病毒RNA水平相当，免疫应答差异不能仅归因于D388-Beau(S)病毒滴度的降低。这些发现支持持续先天免疫激活与D388-R增强毒力之间的关联。其他使用嗜肾性IBV毒株的研究也表明，Toll样受体（TLRs）识别IBV S糖蛋白，产生IL1B、IL6、IL18、NFκβ和IFNγ，与气管和肾脏病变相关。
综上所述，本研究增进了对IBV致病性中病毒因子的理解，特别指出S蛋白在嗜肾致病性中的潜在贡献作用。Beaudette S基因提供了一种潜在通用的途径，可用于开发理性减毒、可在细胞培养中生产的重组IBV疫苗，既减少对鸡胚的依赖，又可加速对新兴和地方性IBV毒株及变异株的响应能力。
