用于体外与体内研究的双报告基因重组严重急性呼吸综合征冠状病毒2奥密克戎BA.5毒株

《Microbiology Spectrum》：A bireporter recombinant SARS-CoV-2 Omicron BA.5 for in vitro and in vivo studies

　　

持续出现的值得关注变异株（variant of concern，VoC）对有效控制严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）构成重大挑战。尽管已成功研发并应用FDA批准的疫苗与抗病毒药物用于感染预防和免疫治疗，但近期VoC可逃逸既往疫苗与抗病毒策略所获得的保护。评估预防性或治疗性手段对近期VoC的效力，有助于更高效控制当前流行株。研究人员利用既往描述的基于细菌人工染色体（bacterial artificial chromosome，BAC）的奥密克戎BA.5反向遗传学系统，生成在病毒核衣壳（N）蛋白位点表达ZsGreen与纳米荧光素酶（Nanoluciferase，Nluc）融合蛋白、并由猪捷申病毒-1（porcine teschovirus-1，PTV-1）2A蛋白酶切位点分隔的重组BA.5（rBA.5 ZsG-Nluc）。该重组病毒复制水平与重组BA.5野生型（rBA.5 WT）相当，在培养细胞中高表达ZsG与Nluc，可借助EC50与NT50值鉴定抗病毒药与中和抗体，结果类似于rBA.5 WT。在角蛋白-18人血管紧张素转换酶2（Keratin-18 human angiotensin-converting enzyme-2，K18 hACE2）小鼠中，rBA.5 ZsG-Nluc保留与rBA.5 WT相同的致病性与肺部复制能力。研究人员利用活体成像系统（in vivo imaging system，IVIS）在感染小鼠体内系统性检测Nluc活性，并在肺组织检测到Nluc与ZsG表达。结果表明，rBA.5 ZsG-Nluc可用于体外、离体及体内追踪病毒感染并鉴定近期SARS-CoV-2 VoC的预防与治疗制剂。

研究背景方面，SARS-CoV-2自COVID-19大流行以来持续进化，突破性感染与免疫逃逸促使BA.1、BA.5等VoC不断出现。FDA批准的主要抗病毒药包括靶向主蛋白酶（main viral protease，Mpro）的Paxlovid（nirmatrelvir+ritonavir）以及靶向RNA依赖RNA聚合酶（RNA-dependent RNA polymerase，RdRp）的Remdesivir和Molnupiravir；但临床单药治疗已出现对Paxlovid与Remdesivir的耐药突变。传统用病毒蛋白抗体检测感染成本高、耗时长，天然分离株又不能在体内追踪感染动态，因此需要代表当前流行株且带报告基因的重组病毒。研究人员基于此开展本研究，构建奥密克戎BA.5双报告基因重组病毒rBA.5 ZsG-Nluc，证明其复制、致病性与野生型相当，并可同时用荧光蛋白ZsGreen与荧光素酶Nluc在细胞、离体组织与活体动物中读取感染信号。该研究发表于《Microbiology Spectrum》，意义在于为近期VoC的抗病毒药与中和抗体（neutralizing antibody，NAb）筛选、体内病理评估提供可量化、可影像化的平台，并可与祖先株WA.1的mCherry-Nluc病毒组合，在同一孔中同时评价对原始株与奥密克戎株的干预效果。

关键技术方法上，研究人员采用基于BAC的反向遗传学系统在Vero AT与A549-hACE2细胞体系中进行病毒拯救；使用PTV-1 2A自切割位点将ZsG-Nluc插入N蛋白位点；以K18 hACE2转基因小鼠（5–8月龄雄性，购自The Jackson Laboratory）作为体内队列；结合IVIS活体与离体成像、微中和试验、双报告基因共感染 assay、连续传代与纳米孔下一代测序（next-generation sequencing，NGS）评估稳定性与突变。

研究结果如下。Generation and in vitro characterization of rBA.5 ZsG-Nluc：研究人员在Vero AT细胞感染后在12 hpi用荧光显微镜观察，ZsG信号与N蛋白TxRed信号共定位，证明ZsG随N抗原表达，rBA.5 WT无ZsG信号。Viral growth kinetics and plaque phenotype：在MOI=0.001下比较时序滴度，CPE、ZsG、Nluc与滴度均在48 hpi达峰；rBA.5 ZsG-Nluc与rBA.5 WT滴度总体相当，斑块试验中只有报告株发荧光与发光，晶体紫显示野生型斑块略大。Microneutralization assays for the identification of antivirals and NAbs：在A549-hACE2细胞用Paxlovid、Remdesivir及NAb 1212C2、1301B7检测，rBA.5 ZsG-Nluc与rBA.5 WT的EC₅₀、NT₅₀接近；1212C2不中和奥密克戎，1301B7可中和两株。双报告 assay 中rWA.1 mCherry-Nluc与rBA.5 ZsG-Nluc共用时可同时读出红绿信号，Paxlovid、Remdesivir及1301B7对两株均显剂量依赖抑制，1212C2仅抑祖先株。Genetic stability of rBA.5 ZsG-Nluc：P2传至P6后斑块仍ZsG/Nluc阳性，Nluc活性跨代稳定；NGS显示NSP9（T21I）、NSP14（M58I）、S（V971G）、E（ΔV14）、N（L13P）及N转录调控序列（transcriptional regulatory sequence，TRS）有高频突变，但ZsG-Nluc融合体与PTV-1 2A序列未突变。Pathogenicity of rBA.5 ZsG-Nluc in K18 hACE2 transgenic mice：5×10⁵ PFU滴鼻感染后，IVIS在1、2、4、6 dpi检出全身Nluc信号并随时间增强；rBA.5 ZsG-Nluc与rBA.5 WT体重下降与6–7 dpi死亡曲线无显著差异。Viral replication of rBA.5 ZsG-Nluc in K18 hACE2 transgenic mice：在2与4 dpi取肺与鼻甲（nasal turbinate，NT），活体/离体Nluc、ZsG信号均只在报告株出现且4 dpi强于2 dpi；肺与NT匀浆Nluc可读，斑块试验滴度在两种病毒间无统计差异。

讨论部分总结：研究人员指出，报告基因病毒克服天然株不能体内追踪、抗体检测繁琐的缺点；N位点插入高表达策略不造成明显衰减。传代突变中V971G位于S2七肽重复1区，E蛋白V14缺失、N蛋白L13P及N TRS突变可能影响适合度但与报道的免疫逃逸/培养适应有关，未改变报告盒本身。双报告 assay 无超感染排斥现象，适于原始株与奥密克戎同孔筛选。体内BA.5致K18 hACE2小鼠高发病，但未在本模型中检及脑感染，未来可用该报告株扩查肺外器官。

结论部分翻译：研究人员描述并表征了一种双报告基因（ZsGreen-NanoLuc）重组SARS-CoV-2奥密克戎BA.5毒株，该毒株是适用于体外、离体与体内研究、包括针对近期SARS-CoV-2变异株治疗药物鉴定与表征的有用工具。该双报告株可单独使用，也可在双报告 assay 中与祖先WA.1株联用，从而在单一 assay 中同时鉴定针对原始与较新出现SARS-CoV-2株的治疗制剂。