近红外荧光蛋白标记系统用于鼠疫耶尔森菌感染动态的实时追踪

《Microbiology Spectrum》：Real-time tracking of Yersinia pestis infection dynamics using a near-infrared fluorescent protein labeling system

　　

活体成像对于阐明动态感染过程至关重要。研究人员开发了一种基于近红外荧光蛋白（NIR-FP）的标记策略，可在细胞与动物感染模型中实现对细菌行为的整合可视化。以鼠疫耶尔森菌（Yersinia pestis）为模式病原体，研究人员通过将该NIR-FP miRFP670nano3编码基因在强内源启动子控制下染色体插入，获得Yp-nano3；或导入表达同一报告基因的质粒，获得Yp-p-nano3。两种标记菌株的荧光强度与细菌数均高度相关，且相同菌量下Yp-nano3亮度显著更高。在测试实验条件下，标记菌株毒力无可见下降，支持其在生理相关感染研究中的使用。细胞感染实验中，标记菌持续强荧光可连续监测病原-宿主细胞互作达12 h。小鼠腺鼠疫模型中，Yp-nano3感染后在腹股沟淋巴结（ILN）于感染后1天即可检出自荧光并渐进增强至死亡；而携带同NIR-FP标签的高度减毒Δpla突变株在ILN始终无检出信号。结果表明，NIR-FP标记联合体内成像可实时追踪Y. pestis向淋巴结播散并评估细菌毒力，建立了适用于感染动态与宿主-病原互作实时分析的NIR-FP标记平台。

研究背景方面，鼠疫耶尔森菌（Yersinia pestis）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）及化脓性链球菌（Streptococcus pyogenes）等病原体常经机械损伤或媒介传播引发皮下感染，再经淋巴循环进展为全身感染。病原体向淋巴结（lymph node）播散、复制与定植决定感染严重程度和疾病结局。传统方法需在不同时间点处死动物测菌载量，终点法耗时费力且无法在同一主体内连续追踪。活体成像（live imaging）虽可连续监测，但生物发光成像（bioluminescence imaging）依赖外源底物且难研究病原-细胞直接互作；绿色/红色荧光蛋白（GFP/RFP）受组织穿透差和自发荧光干扰。近红外（near-infrared, NIR）荧光具有低吸收、低散射和深穿透优势，但NIR荧光蛋白（NIR-FP）用于细菌感染动态可视化仍有限。因此，研究人员以Y. pestis为模型建立NIR-FP标记体系，相关论文发表于《Microbiology Spectrum》。

关键技术方法方面，研究人员使用Y. pestis 201株（生物型Microtus，对人无毒力）及Δpla减毒突变株；宿主细胞为RAW264.7巨噬细胞；动物为6–8周龄雌性BALB/c小鼠（北京维通利华），经腹股沟区皮下感染约1000 CFU。核心方法包括CRISPR-Cas12a（FnCpf1）介导染色体插入miRFP670nano3与血红素氧合酶-1（HO-1）基因、质粒转导表达系统、体外平板与高内涵成像（HCI）、小鼠活体成像系统（IVIS）动态追踪，以及离体器官菌载量与荧光定量。

研究结果如下。建立miRFP670nano3标记方法部分，研究人员以假基因yp_3493为高转录插入位点，用ymt启动子驱动miRFP670nano3，并共表达HO-1以供给胆绿素发色团，染色体整合获201-nano3；并行将pBR322-IP3-miRFP670nano3转入201获201-p-nano3。结论为该双体系可提供稳定NIR标记。

miRFP670nano3标记的Y. pestis体外荧光表征部分，研究人员对菌株五倍稀释点板并用IVIS成像，发现201-nano3荧光强于201-p-nano3；log₁₀菌数与荧光信号强线性相关，检测限约100 CFU；显微镜下单菌均匀发光，201-nano3平均荧光强度（MFI）约为201-p-nano3的1.5倍。结论为两株均适细胞内与体内追踪。

miRFP670nano3标记对Y. pestis生长与毒力影响有限部分，研究人员比较野生株、空载体株与荧光株36 h生长曲线，并皮下感染小鼠评估生存。结果显示生长曲线面积无显著差异，1000 CFU下生存曲线无显著区别。结论为染色体插入或质粒导入不显著影响生长与毒力。

利用miRFP670nano3标记Y. pestis实时成像细菌-宿主互作部分，研究人员将CellTracker Green预染RAW264.7细胞，以MOI=5感染并HCI连续观察12 h。可见胞内菌点状信号，随时间信号减弱，提示被巨噬细胞清除。结论为该体系可研究细菌-宿主细胞互作至多12 h。

腺鼠疫小鼠模型中miRFP670nano3标记Y. pestis体内播散的活体追踪部分，研究人员每日IVIS成像发现201-nano3组感染后1天ILN现弱信号并递增，4天累及邻近淋巴结；201-p-nano3至2天仍难检出，3天时信号为前者的七分之一；Δpla-p-nano3七日内外周与ILN均无信号。离体显示肝、脾菌载量可达10⁷–10⁸ CFU/g，但体内仅浅层ILN可测，肝3天、脾4天才离体检出。结论为NIR-FP可量化毒力衰减与淋巴结播散，但深器官体内穿透受限。

讨论部分总结，活体成像需高效标记；染色体单拷贝miRFP670nano3因强ymt启动子与高转录位点反而亮于多拷贝质粒株，说明启动子与位点选择关键。相较Cy5.5/Cy7染料探针需反复标记且随分裂衰减，NIR-FP可数日稳定监测复制。相较Daiki Yamaguchi等的TokeOni-荧光素酶NIR生物发光法需底物注射，本平台无需底物便可看细胞互作。局限是信号主要在淋巴结，腹股沟接种点因约500 CFU/侧低于IVIS阈值不显影，肝牌深位受光子吸收散射限制；更亮更深穿透NIR-FP是改进方向。

结论部分翻译：活体成像可对体内病原感染动态进行非侵入实时监测，是传染病研究关键手段。有效标记策略决定成像成败。研究人员建立两种NIR-FP标记法：质粒表达miRFP670nano3，或基因组整合该基因，后者更稳定更亮。IVIS与Operetta CLS证实两株在体与离体均发光，且都不影响生长与毒力，可在小鼠腺鼠疫模型实时追踪播散。ymt启动子驱动使单拷贝201-nano3亮于多拷贝201-p-nano3，凸显强启动子与高转录位点价值。相较染料探针需重复标记且随复制变暗，本方法可多日监测Y. pestis复制。相较需TokeOni底物的NIR生物发光系统，本NIR-FP法免注射、便观察互作。该平台在淋巴结追踪潜力显著，但深组织（脾、肺）较弱；更亮深穿透NIR-FP将提升全器官监测能力。