液相牛奶比浊法可在每样品不到一美分的成本下实现铜绿假单胞菌分泌蛋白酶活性的快速表型分析

《Microbiology Spectrum》：Liquid-phase milk turbidimetry enables rapid phenotyping of secreted protease activity in Pseudomonas aeruginosa at less than one cent per sample

　　

分泌蛋白酶是铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）的主要毒力决定因子。其产生在不同菌株和群体感应（QS）背景下差异很大，因此需要简单、标准化的方法定量胞外蛋白水解活性。本文描述了一种液相脱脂牛奶比浊法，使用Tris–CaCl₂缓冲液，并以600 nm处浊度下降（A₆₀₀）作为分光光度终点，对澄清培养上清液中的总分泌蛋白酶活性进行定量。反应在37°C振荡孵育3 h后测定。参考菌株PAO1和PA14、一株QS缺陷双突变体（PAO1ΔlasRΔrhlR）以及两株额外分离株（DVL1758和ATCC 9027）在测定匹配的生长条件下进行了评估。终点培养密度在各菌株间相当（OD₆₀₀约3.4–4.0；单因素方差分析（ANOVA），P > 0.05），支持将A₆₀₀差异解释为胞外活性表型。该方法在两种实际底物载量（2 mg和5 mg）下可分辨菌株依赖的牛奶澄清作用，区分低、中、高蛋白水解表型，其中QS突变体表现出最小澄清作用。实验室内精密度对生物测定而言可接受（各菌株和各载量下CV < 20%）。跨载量稳健性由2 mg和5 mg平均A₆₀₀值之间的强一致性支持（Pearson r = 0.861，P = 0.0277，R² = 0.741；排除培养基对照后r = 0.954，R² = 0.910）。这种低成本、广泛可及的工作流程能够对分泌蛋白水解表型进行快速比较分析，并在需要机制分辨率时，补充更特异的基于底物或正交验证方法。

铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）是一种临床重要的机会性致病菌，可引起急慢性感染。其分泌的多种蛋白酶（包括弹性蛋白酶LasB、碱性蛋白酶AprA、LasA蛋白酶和蛋白酶IV等）是主要毒力因子，参与营养获取、组织破坏和免疫逃逸。这些蛋白酶的产量受群体感应（QS）系统调控，在不同菌株和调控背景下差异很大，因此需要简单、标准化的方法定量胞外蛋白水解活性。现有方法中，脱脂牛奶琼脂平板透明圈法简便但受扩散和菌落生长影响，难以准确定量；偶氮酪蛋白、弹性蛋白-Congo红和荧光肽等液体方法虽可定量，但常依赖特殊底物、成本高、操作复杂。为克服这些限制，研究人员开发并验证了一种液相脱脂牛奶比浊法：以脱脂奶粉为底物，在Tris–CaCl₂缓冲液中加入澄清培养上清，37°C振荡孵育3 h后测定600 nm浊度损失（A₆₀₀），以反映总分泌蛋白酶活性。研究菌株包括参考菌株PAO1和PA14、QS缺陷双突变体PAO1ΔlasRΔrhlR、环境分离株DVL1758和临床分离株ATCC 9027。结果显示，各菌株在测定匹配条件下16 h培养终点密度相当（OD₆₀₀约3.4–4.0，单因素方差分析（ANOVA）P > 0.05），因此A₆₀₀差异可解读为胞外活性差异。在2 mg和5 mg两种底物载量下，该法可区分低、中、高蛋白水解表型：QS突变体和仅培养基对照几乎不降解牛奶，PAO1和PA14活性最高，ATCC 9027在5 mg下呈中等活性，DVL1758在5 mg下与高活性菌株聚类。实验室内精密度可接受（CV < 20%），跨载量稳健性强（2 mg与5 mg平均A₆₀₀的相关性r = 0.861，排除对照后r = 0.954）。该工作发表在《Microbiology Spectrum》。

在方法上，研究人员使用了来自不同来源的菌株队列：PAO1（1950年澳大利亚伤口分离株）、PA14（烧伤创面分离株）、PAO1ΔlasRΔrhlR（实验室构建的QS双突变体）、DVL1758（浅塘环境分离株）