《Renal Failure》：Mitochondrial extracellular vesicles in cardiorenal syndrome: emerging mediators of mitochondrial signaling and inter-organ crosstalk
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心肾综合征（cardiorenal syndrome, CRS）包含五种临床特征不同的急性、慢性或系统性心肾相互作用模式。线粒体功能障碍是心脏和肾脏损伤的共同特征，但心肾背景的特殊之处在于，一个器官中产生的线粒体应激可能被外化并传递至另一个器官。细胞外囊泡（e
心肾综合征（cardiorenal syndrome, CRS）包含五种临床特征不同的急性、慢性或系统性心肾相互作用模式。线粒体功能障碍是心脏和肾脏损伤的共同特征，但心肾背景的特殊之处在于，一个器官中产生的线粒体应激可能被外化并传递至另一个器官。细胞外囊泡（extracellular vesicles, EVs）是已确立的细胞间通讯介质，携带线粒体DNA（mitochondrial DNA, mtDNA）、蛋白质、脂质、RNA或结构完整的线粒体物质的EVs——在此统称为线粒体细胞外囊泡（mitochondrial extracellular vesicles, mitoEVs）——可能将线粒体质量控制与系统性信号传导联系起来。然而，直接针对CRS的特异性证据仍然有限：患者来源的研究支持总循环EVs的致病效应，而大多数mitoEV特异性机制是从相关的心血管、肾脏、炎症、癌症或再生模型中推断而来。因此，本综述提出的是一个基于证据分级的概念框架，而非确定性的机制总结。研究人员对mitoEVs进行了定义和分类，概述了其分离、同颗粒鉴定、货物拓扑分析、定量和功能验证的方法学要求，并绘制了五种CRS亚型中的现有证据图谱。研究人员进一步提出mitoEV–线粒体自噬–炎症轴作为工作假说，其中受损的线粒体质量控制可能有利于囊泡输出、受体细胞中的炎症激活以及继发性线粒体功能障碍。最后，研究人员评估了mitoEVs的生物标志物和治疗潜力，同时强调需要亚型特异性临床验证、标准化分析流程、来源解析研究，以及严格区分病理性与修复性囊泡群体。
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引言
心肾综合征（cardiorenal syndrome, CRS）涵盖以心脏和肾功能障碍之间双向相互作用为特征的一系列疾病。根据急性透析质量倡议分类，CRS包括1型（急性心功能不全导致急性肾损伤）、2型（慢性心功能不全导致进行性肾功能损害）、3型（急性肾损伤导致急性心功能不全）、4型（慢性肾脏病导致慢性心脏损伤或心力衰竭）和5型（全身性疾病导致心脏和肾脏同时功能障碍）。这些亚型在起始器官、时间进程、血流动力学环境、炎症负荷以及循环信号的潜在来源和动力学方面各不相同。血流动力学紊乱、神经激素激活、静脉淤血、炎症和氧化应激仍是CRS的核心，但不能完全解释细胞损伤如何在远隔器官之间传播。
线粒体功能障碍是心脏和肾脏损伤的共同病理特征。心肌细胞和肾小管上皮细胞高度依赖能量，易受氧化磷酸化、线粒体动力学、氧化还原稳态和线粒体自噬紊乱的影响。心肾背景不同于孤立的心脏或肾脏疾病，因为线粒体损伤发生在一个时间和方向耦合的双器官系统中：心功能不全可能使肾脏暴露于低灌注、淤血、神经激素激活和循环炎症介质，而肾功能障碍则产生可损害心脏代谢和功能的尿毒症、氧化和炎症环境。在5型CRS中，两个器官可能同时受损，循环囊泡可能来自多种组织和血细胞群体。因此，核心问题不仅在于线粒体功能障碍是否发生，还在于线粒体应激如何转化为可传播或维持心肾损伤的移动信号。
细胞外囊泡（extracellular vesicles, EVs）日益被认为是心血管和肾脏疾病中细胞间和器官间通讯的介质。从CRS患者中分离的循环EVs在肾脏芯片系统中诱导肾上皮和内皮损伤，为致病性循环总EVs提供了直接功能证据，但其器官来源或mitoEV特异性贡献尚未明确。在慢性肾脏病（chronic kidney disease, CKD）中，EVs也被研究作为炎症、纤维化、凋亡和氧化应激的生物标志物和介质。
除常规EV货物外，实验研究表明EVs可运输线粒体DNA（mitochondrial DNA, mtDNA）、线粒体蛋白、调控RNA、脂质，并在特定情况下运输结构保留的线粒体物质，从而改变受体细胞中的线粒体稳态。这些观察激发了对线粒体细胞外囊泡（mitochondrial extracellular vesicles, mitoEVs）的兴趣，mitoEVs是携带线粒体成分的异质性操作类别EVs。
mitoEVs必须与细胞内线粒体来源囊泡（mitochondria-derived vesicles, MDVs）区分开来。MDVs从线粒体膜选择性出芽，主要介导细胞内质量控制，而mitoEVs是在分泌后检测到的细胞外颗粒。当线粒体货物从细胞内降解转向细胞外释放时，这两条途径可能交叉，但它们并非同义词。
含线粒体货物的EVs的功能后果是背景依赖性的。富含线粒体损伤相关分子模式的囊泡可能放大炎症，而干细胞来源或工程化EVs可在实验性损伤模型中稳定线粒体稳态并恢复生物能量学。然而，大多数CRS研究分析了总EV群体而未解析线粒体亚型，且尚未建立跨心肾轴的mitoEV特异性因果通路。
本综述定义并分类mitoEVs，总结其鉴定和功能验证的实际要求，考察线粒体功能障碍作为囊泡信号来源，绘制五种CRS亚型中的证据，并讨论生物标志物和治疗意义。研究人员还提出mitoEV–线粒体自噬–炎症轴作为可检验的工作假说，而非已确立的CRS机制。
为区分证据与生物学合理性，研究人员使用三个证据等级。1级指来自CRS患者或实验模型的直接证据，将总EV证据与mitoEV特异性证据分开。2级指来自相关心血管、肾脏或全身性疾病模型的机制证据。3级指尚未直接测试的对CRS的理论外推。
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mitoEVs的定义与分类
线粒体细胞外囊泡（mitoEVs）通常被理解为携带线粒体成分（包括线粒体蛋白、脂质、mtDNA、mtRNA，或在某些情况下结构保留的线粒体）的细胞外囊泡。该定义在概念上有用，但不应被解释为暗示统一的囊泡群体。mitoEVs代表在不同生理和病理条件下产生的异质性细胞外颗粒群体，范围从常规EV分泌到应激诱导的细胞器挤出。
mitoEVs的仔细定义需要两个区分。首先，mitoEVs应与总EVs区分。当前EV领域建议通过物理性质、分子标记和分离程序的组合来表征囊泡，而非仅凭单一标记或大小范围。因此，mitoEV制剂理想上应同时证明EV身份（如CD9、CD63、CD81、TSG101或ALIX富集）和线粒体身份（如TOMM20、TIM23、COX IV、VDAC1、ATP5A1、TFAM、心磷脂或mtDNA）。其次，mitoEVs应与细胞内线粒体来源囊泡（MDVs）区分。MDVs通过线粒体膜选择性出芽产生，主要作为细胞内质量控制中间体，而mitoEVs是将线粒体货物递送至细胞外空间或受体细胞的细胞外颗粒。
鉴于这种异质性，基于生物发生的分类比基于大小的分类更合理。目前至少有四条生物发生途径与mitoEV生物学相关。第一条是内体或多囊泡体途径，线粒体物质被纳入EVs，在多囊泡体与质膜融合后释放。一项近期机制研究表明，溶酶体抑制或Rab7缺陷可促进含线粒体的大EVs分泌。这些囊泡携带ALIX、TSG101、CD81和CD63等EV标记以及TOMM20、TIMM23、MT-CO1和SOD2等线粒体蛋白，作者得出结论：当溶酶体降解受损时，EVs中的线粒体分泌可作为替代清除途径。
第二条途径是质膜出芽，产生微囊泡型mitoEVs。该机制在细胞应激下尤其相关，此时线粒体碎片、mtDNA、氧化线粒体物质甚至完整细胞器可能被重定向至外向出芽和细胞外释放。在全身性炎症背景下，该途径在生物学上很重要，因为微囊泡释放可将细胞内线粒体损伤转化为细胞外炎症信号。
第三条途径是自噬或线粒体自噬相关分泌。当线粒体自噬的降解臂不完整或不堪重负时，线粒体货物可能被转向非经典分泌途径。该概念尚不如内体和微囊泡途径成熟，但很重要，因为它将mitoEV生物学与线粒体自噬通量联系起来。
第四条途径包括更大或更特化的线粒体挤出机制。外泌体（exophers）最初被描述为从神经元中去除蛋白聚集体和受损细胞器（包括氧化线粒体）的大细胞外囊泡结构。迁移体介导的线粒体胞吐（mitocytosis）随后被报道为迁移细胞中的线粒体质量控制过程，受损线粒体被转运至迁移体并在细胞外处理。最近，线粒体吞噬发生（mitopherogenesis）被描述为精子发育过程中线粒体特异性胞吐过程，产生含有单个线粒体的囊泡。
基于标记的分类对实验报告有用，但应保持操作性而非分类学性。实用方法是描述囊泡制剂为线粒体标记阳性EVs，同时指明分离方法和生物来源。大小命名应谨慎使用，因为大小可支持表征但不能单独定义mitoEV亚型。
本综述中，仅当EV身份和线粒体货物均被证明时，才使用“mitoEVs”作为伞形操作术语。研究人员主要按拟议的生物发生分类这些制剂，同时避免基于大小或单一标记的分类学主张。
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mitoEV鉴定与功能验证的方法学框架
MISEV2023提供了EV命名、分离、表征、污染物评估、剂量报告和功能研究的最低通用框架，但未建立mitoEV特异性诊断标准。操作鉴定需要趋同证据：EV身份、线粒体货物、在可行时确认两种特征出现在同一颗粒内，以及排除非囊泡性线粒体物质。血液研究应按照MIBlood-EV原则报告采集、抗凝剂、处理延迟、离心、血小板去除、溶血、储存和冻融历史。尿液研究应记录采集条件、体积或流量、肌酐、渗透压、蛋白尿、储存和尿调节素干扰。
由于没有单一程序可选择性地分离所有mitoEV亚型，分阶段富集和验证策略更可取。标准化生物体液处理后，可通过尺寸排阻色谱、密度梯度离心或正交组合方法获得EV富集级分。血浆制剂应评估白蛋白、载脂蛋白、血小板来源颗粒和其他非EV污染物；尿液制剂应评估蛋白聚集体、尿调节素和非囊泡性核酸。使用TOMM20、VDAC1、EV表面标记或其他可及抗原的免疫亲和捕获可富集亚群，但不能独立定义mitoEVs。
EV身份应通过互补的物理和分子方法支持，线粒体身份应通过不止一种线粒体成分支持。EV相关标记和线粒体标记的批量共检测不能证明两者存在于同一颗粒上。因此，在技术上可行时应使用纳米流式细胞术、成像流式细胞术、单颗粒免疫分析、超分辨成像或免疫金电子显微镜进行同颗粒确认。蛋白酶或核酸酶保护实验可用于区分外部相关物质与受保护的囊泡内货物。
定量应报告多个分母，包括总颗粒数、EV标记阳性颗粒、线粒体标记阳性EVs以及每颗粒或每EV标记阳性颗粒的线粒体货物。尿液测量应额外使用尿液肌酐、渗透压和定时排泄等互补措施归一化。回收对照和匹配的非囊泡级分对于确定分子或生物学信号是否真正与EV相关是必要的。
检测线粒体货物并不能确立功能性转移。令人信服的证据应证明货物与特征化EV群体相关、被受体细胞摄取、递送至相关细胞内区室，并产生货物依赖性生物学效应。供体特异性mtDNA变异、线粒体靶向报告基因或EV膜和线粒体货物的互补标记可追踪转移，而受体细胞耗氧率、呼吸储备、ATP产生、膜电位、呼吸复合物活性或mtDNA缺陷细胞挽救可评估功能。因果关系应通过供体细胞货物耗竭或修饰、EV耗竭和非囊泡级分、去污剂破坏的EVs、核酸酶或蛋白酶对照以及功能丧失和挽救实验来测试。
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线粒体功能障碍作为CRS中囊泡信号的来源
CRS中的线粒体功能障碍应被概念化为超越局部生物能量衰竭的动态系统级过程。在心脏和肾脏中，线粒体不仅是能量产生细胞器，还是氧化还原信号、细胞死亡途径和先天免疫激活的核心调节因子。在病理条件下，线粒体稳态的破坏导致受损线粒体积累，从而使线粒体成为应激信号的主动来源而非被动损伤受害者。
在心肌细胞中，线粒体功能障碍以氧化磷酸化受损、代谢不灵活和过量线粒体活性氧（mitochondrial reactive oxygen species, mtROS）产生为特征。这些改变促进mtDNA损伤、脂质过氧化和线粒体通透性转换激活，最终导致收缩功能障碍和细胞死亡。同时，肾小管上皮细胞在急性肾损伤（acute kidney injury, AKI）和CKD中均表现出早期线粒体碎片化、膜电位丧失和氧化代谢受损。
线粒体功能障碍的关键后果是线粒体损伤相关分子模式（mitochondrial damage-associated molecular patterns, mtDAMPs）的产生和释放，包括mtDNA、氧化线粒体蛋白、心磷脂和线粒体RNA。这些分子可激活cGAS–STING、Toll样受体和炎症小体途径，将线粒体损伤与炎症放大联系起来。然而，细胞外mtDAMPs在物理形式上具有异质性，可能以游离循环或蛋白相关分子、附着于EV表面的物质、受保护的囊泡内货物、线粒体碎片或细胞外线粒体形式存在。
EV分泌是线粒体成分受控输出的潜在途径之一。在线粒体应激或降解受损时，选定的货物可被包装进细胞外囊泡。当线粒体自噬或溶酶体处理不足时，线粒体物质可能从细胞内降解转向细胞外输出。
这种拟议的线粒体自噬向输出转变提供了细胞内质量控制失败与系统性信号传导之间的概念桥梁。在CRS中，心脏或肾脏的持续线粒体应激可能通过囊泡外化并影响远隔细胞，但该序列尚未被确立为因果性跨器官途径。
重要的是，这种囊泡介导的线粒体货物释放不应被视为统一过程。含线粒体货物EVs的组成和功能影响可能取决于线粒体损伤严重程度、线粒体自噬效率和细胞背景。
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CRS中双向EV/mitoEV介导的心肾串扰
直接涉及mitoEVs在CRS中的证据有限。以下部分将总EVs的功能数据与相关疾病模型中的mitoEV特异性发现以及对心肾信号的理论外推分开。
5.1 心脏到肾脏信号
最强的心脏到肾脏证据来自CRS患者循环EVs，其在肾脏芯片系统中诱导肾上皮和内皮损伤。这构成1级证据，证明CRS患者的循环总EVs可损伤肾细胞。然而，这并未确立囊泡来自心脏或线粒体货物介导了该效应。
2级证据来自心肌梗死，显示心脏成纤维细胞来源的富线粒体小EVs携带受损线粒体成分，可激活NLRP3依赖性炎症并促进不良心室重构。这些制剂表现出小EV特征并含有线粒体信号和蛋白，但未证明结构完整的线粒体。其损伤肾受体细胞或介导CRS的能力尚未被测试。
全身性炎症模型为线粒体应激的囊泡性传播提供了额外2级支持。在脓毒症诱导的心肌功能障碍中，微囊泡释放与线粒体自噬通量破坏和炎症放大相关。
5.2 肾脏到心脏信号
CKD为肾脏到心脏通讯提供了相对较强的总EVs证据。来自患者和实验性CKD模型的循环EVs诱导心肌细胞凋亡并损害收缩功能，EV耗竭改善心脏性能。这些发现构成4型样心肾疾病中致病性循环EV途径的1级证据，尽管验证的货物主要是非线粒体的。
肾损伤模型分别显示EVs可包含或转移线粒体物质并改变代谢或炎症反应。这构成2级机制证据，证明肾应激可产生具有生物学活性的含线粒体货物EVs。肾脏来源mitoEVs解释CKD中观察到的心脏毒性效应的命题仍为3级。
5.3 将EV和mitoEV证据映射到五种CRS亚型
五种CRS亚型为解释EV和mitoEV证据提供了临床相关框架。1型有CRS患者循环总EVs引起肾损伤的直接证据，但无来源解析的心脏mitoEV证据。4型有CKD中心脏毒性总EVs的直接证据，而线粒体贡献仍为间接。2型和3型的mitoEV介导信号证据主要从慢性心力衰竭、AKI或肾线粒体损伤模型外推。5型特别难以解析，因为全身性炎症可同时刺激心脏、肾脏、内皮、血小板和免疫细胞的EV释放。
目前没有可重复的分子特征区分心脏来源与肾脏来源的mitoEVs。
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CRS中拟议的mitoEV–线粒体自噬–炎症轴
一个核心未解问题是局部线粒体功能障碍是否可通过囊泡信号演变为系统性、自我放大的过程。研究人员提出mitoEV–线粒体自噬–炎症轴作为工作假说而非已确立的CRS机制。各环节主要由相关疾病模型的2级证据支持，完整序列尚未在任何CRS亚型中得到证明。
生理条件下，线粒体质量控制途径去除或隔离受损物质并限制mtDAMPs的细胞外释放。心脏和肾损伤可破坏线粒体自噬和线粒体质量控制。当溶酶体降解不足时，选定的线粒体物质可能转向EV相关输出。
多个分子检查点可能影响货物命运。PINK1和Parkin参与应激诱导的MDV形成和溶酶体货物递送。OPA1和SNX9依赖性MDVs可促进线粒体蛋白选择性掺入EVs，而Parkin通过将受损货物导向溶酶体降解来限制该过程。PINK1依赖性mtDNA包装进EVs也已在癌症模型中得到证明。BNIP3、NIX和FUNDC1是缺氧心脏和肾应激中的重要线粒体自噬受体，但直接证据表明它们调节细胞外mitoEV释放的证据缺乏。
疾病模型证据也支持囊泡线粒体货物与先天免疫之间的联系。在受体细胞中，EV相关mtDNA可激活cGAS–STING或内体TLR9–MyD88–NF-κB信号，而氧化线粒体蛋白或脂质可能促成NLRP3炎症小体激活。
这些观察支持一个假设性反馈序列：线粒体质量控制不足有利于囊泡输出，含线粒体货物EVs激活受体细胞中的炎症反应，炎症进一步损害线粒体功能。该模型为进行性跨器官损伤提供了可检验的解释，但尚无CRS特异性研究证明完整因果序列。
该模型也是背景依赖性的而非统一致病性。干细胞来源或工程化EVs在肾和心损伤模型中均显示出修复性线粒体效应。在AKI中，间充质干细胞（mesenchymal stem cell, MSC）来源EVs可稳定mtDNA并恢复线粒体生物能量学，而诱导多能干细胞来源心肌细胞富线粒体EVs可转移功能性线粒体、增强线粒体生物发生并改善心肌能量学和梗死后心脏功能。
验证将需要CRS特异性模型，结合连续和来源解析的mitoEV分析、货物或释放途径的直接操作、供体和受体组织中线粒体自噬通量的测量以及同步心脏和肾脏结局。
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mitoEVs在CRS中的治疗和生物标志物意义
线粒体功能障碍可通过EV介导途径外化的认识提出了关于mitoEVs在CRS中诊断和治疗潜力的重要转化问题。
7.1 mitoEVs作为CRS中线粒体应激的生物标志物
mitoEV研究的一个潜在应用是生物标志物开发。循环EVs正在心血管和肾脏疾病中被研究，但总血浆mtDNA不等同于囊泡相关mtDNA。候选mtDNA阳性mitoEV生物标志物需要EV富集级分、正交EV和线粒体表征、膜透化前后DNase分析、匹配的非囊泡级分以及颗粒和标记阳性EV计数的归一化。
尿液EVs可保留肾单位节段的分子特征，但其测量受水合状态、尿流、渗透压、蛋白尿、肌酐、采集时间、储存和尿调节素影响。近期人类研究支持可行性但尚未验证CRS。足细胞来源的含mtDNA尿液大EVs与儿童肾病综合征复发相关，而独立评估的尿液EV蛋白特征已在早期肾损伤患者中报道。
临床转化需要前瞻性、亚型分层研究，使用标准化前分析、操作鉴定框架、连续心脏和肾脏表型分析以及独立验证队列。
7.2 mitoEV途径的治疗靶向
从治疗角度看，mitoEV途径可通过减少病理性囊泡的释放或摄取、中和损伤性货物或使用修复性EVs作为递送平台来靶向。EV形成或释放的抑制可在选定心血管和肾模型中减轻损伤，但这些研究并非mitoEV特异性。
干细胞来源EVs可转移线粒体成分、恢复生物能量功能并减少实验性心脏和肾损伤中的炎症。工程化EVs可能增强线粒体递送或组织靶向，但这些发现仍处于临床前阶段。
重要的是，mitoEVs的双重性质需要在治疗设计中仔细考虑。目前，病理性与修复性mitoEV群体不能仅凭囊泡大小或常规EV标记谱可靠区分。因此，应避免不加区分地抑制EV释放，因为它可能同时抑制病理性信号和适应性线粒体处理或修复。
多个障碍目前阻碍临床应用。全身给药EVs可能被快速清除或优先在网状内皮器官中积累。靶向配体可能改变药代动力学、膜完整性、免疫原性和摄取。线粒体蛋白、mtDNA、RNAs或完整线粒体的装载仍不稳定。可扩展制造需要控制细胞来源、培养、纯化、无菌性、批次一致性、稳定性和关键质量属性。免疫原性、补体激活、血栓形成性、受损或突变mtDNA转移以及脱靶代谢效应需要系统评估。最重要的是，尚无CRS特异性临床前研究证明选择性抑制病理性mitoEVs或递送修复性mitoEVs可同时改善心脏和肾脏结局。
7.3 未来CRS研究的可测试优先事项
未来五年应优先考虑三个问题。第一，五种CRS亚型是否表现出不同的时间和分子mitoEV特征？这需要前瞻性连续血浆和尿液采样、标准化处理、单囊泡分析和配对心脏和肾脏表型分析。第二，能否证明循环mitoEVs的器官来源和因果性跨器官活性？需要谱系解析模型、供体特异性线粒体变异、器官富集表面标记和选择性货物操作来测试心脏来源mitoEVs是否直接影响肾脏及反之。第三，能否区分病理性与修复性mitoEV群体并在不干扰生理性EV信号的情况下选择性调节？这需要验证的功能标准、机制关联效力分析、生物分布研究以及CRS特异性模型中同步心脏和肾脏获益。
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结论
mitoEVs是生物学上合理但尚未确立的CRS介质。直接证据目前支持选定总循环EV群体的致病效应，而mitoEV特异性跨器官机制主要来自相关疾病模型或理论外推。拟议的mitoEV–线粒体自噬–炎症轴因此是可检验的工作假说而非确定性因果途径。进展将取决于标准化和来源解析的鉴定、同颗粒和货物拓扑验证、功能因果关系实验以及按CRS亚型分层的前瞻性研究。这些步骤也是确定mitoEVs能否成为可靠生物标志物或选择性靶向治疗平台的先决条件。
